Mengenal Teknik-teknik dalam Rekayasa Genetika

Rekayasa genetika adalah kegiatan manipulasi gen dengan teknik DNA rekombinan dengan tujuan mengubah, menghilangkan atau memunculkan ekspresi gen tersebut pada suatu organisme hidup.  Obyek rekayasa genetika mencakup hampir semua golongan organisme, mulai dari bakteri, alga,  fungi, tumbuh-tumbuhan,  hewan tingkat rendah, dan hewan tingkat tinggi. 

Ada beberapa tahapan utama dalam rekayasa genetika, yaitu:

1. Kloning gen
Kloning gen terdiri atas beberapa tahapan, diantaranya memotong DNA  menjadi fragmen-fragmen dengan ukuran beberapa ratus hingga ribuan kb (kilobase), selanjutnya fragmen ini dimasukkan ke dalam vektor bakteri untuk kloning. Berbagai macam vektor didesain untuk membawa DNA dengan panjang yang berbeda. Plasmid, kosmid, faga P1, BAC (bacterial artificial chromosome), dan YAC (Yeast Artificial Chromosome) dapat membawa DNA hingga 20 kb, 40 kb, 90 kb, 200 kb, dan 1000 kb secara berturut-turut. Setiap vektor, hanya mengandung satu fragmen DNA, dimasukkan ke dalam bakteri, yang kemudian teramplifikasi, membentuk suatu klon. Sejumlah besar setiap fragmen DNA kemudian diisolasi dari setiap klon. Ekspresi kloning gen telah disimpan dengan perbanyakan kloning yang dilakukan pada bakteri yang mengandung fragmen DNA tersebut.

Teknik Kloning Gen

Kloning fragmen DNA secara langsung  yang mengandung gen tertentu seringkali tidak bisa dilakukan. Kloning cDNA yang tepat biasanya merupakan tahapan intermediat atau pertengahan. Untuk tujuan ini, mRNA suatu jenis sel diretrotranskripsi menjadi DNA menggunakan enzim reverse-transkriptase virus. DNA untai tunggal yang dihasilkan dengan caran ini kemudian diubah mejadi DNA untai ganda menggunakan DNA polimerase. Fragmen DNA yang dihasilkan selanjutnya dikloning ke dalam plasmid untuk menghasilkan bank cDNA.

2. Sequensing DNA
Sekuensing DNA terdiri atas penentuan urutan basa suatu fragmen DNA. Selama bertahun-tahun  sekuensing dilakukan dengan teknik yang butuh waktu dan proses lama. Sekarang proses ini bersifat automatis dan dilakukan dalam skala industri dan memungkinkan mensekuensing beberapa ribu kilobasa per hari.

3. Amplifikasi gen secara in-vitro
Teknik yang dikenal sebagai PCR (polymerase chain reaction) untuk amplifikasi DNA ini paling sering digunakan oleh praktisi biologi molekuler Teknik PCR mensintesis untaian komplementer suatu fragmen DNA yang dimulai dengan suatu primer. Untuk lebih jelasnya dapat dibaca pada artikel Mengenal Teknik PCR (Polymerase Chain Reaction).

4. Konstruksi Gen
Penelitian gen seringkali membutuhkan konstruksi gen fungsional yang dimulai dari berbagai elemen gen. Elemen-elemen ini mungkin daerah regulator atau mungkin daerah transkrip. Mereka bisa saja dalam struktur asli atau hasil mutasi dengan eksperimen. Konstruksi gen dapat membantu identifikasi daerah regulator yang mengontrol ekspresi gen. Daerah koding atau coding region mungkin mengandung struktur aslinya. Konstruk gen bisa digunakan untuk mengkaji pengaruh gen pada sel atau organisme secara menyeluruh. Daerah transkrip mungkin mengandung suatu gen reporter yang menyandi protein yang bisa dengan mudah divisualisasi atau dikuantifikasi berdasarkan aktifitas spesifik enzimnya.

Rekayasa genetika mungkin dapat digunakan pada skala industri untuk memprogram ulang sel atau organisme untuk menghasilkan rekombinan sifat terkait farmasi dan untuk mencegah  respon penolakan imun pada sel atau organ hasil transplantasi.

Berbagai metode ekspresi gen (Sumber: Houdebine, 2003)

Pada semua kasus, gen harus dikonstruksi secara eksprimen. Konstruks gen mengandung sedikitnya daerah promoter, daerah transkrip, dan daerah terminator. Dengan demikian, suatu konstruk gen kemudian bisa disebut sebagai vektor ekspresi.

Konstruksi gen mengimplikasikan penggunaan enzim restriksi yang memotong DNA pada daerah spesifik, sintesis oligonukleotida secara kimiawi, amplifikasi fragmen DNA secara in-vitro menggunakan teknik PCR, serta menyambungkan fragmen DNA yang berbeda dengan ikatan kovalen menggunakan enzim ligase. Sebagian besar, fragmen ini ditambahkan pada plasmid yang kemudian ditransfer ke dalam bakteri. Klon bakteri kemudian diselksi dan diamplifikasi.

Pemilihan elemen yang ditambahkan pada konstruk tergantung pada tujuan eksperimen dan khususnya pada jenis sel dimana konstruk tersebit akan diekspresikan. Kode genetik bersifat universal, bahkan jika beberapa kodon sering digunakan secara efektif pada jenis sel tertentu dibandingkan sel lain. Kode yang menentukan aktifitas sekuen regulator bersifat spesifik bagi setiap organisme. Promoter dari suatu gen bakteri tidak akan aktif pada sel tumubuhan maupun hewan, begitu pula sebaliknya.

5. Transfer gen ke dalam sel

Suatu gen hasil isolasi dapat ditranskripsi secara in-vitro dan mRNAnya juga dapat  ditranslasikan pada suatu sistem bebas sel. Teknik ini memungkinkan peneliti memperoleh sejumlah protein dalam jumlah kecil, yang mungkin tidak cukup untuk beberapa penelitian biokimia, atau untuk penentuan aktifitas biologi protein tersebut secara in vivo atau menentukan strukturnya melalui proses kristalisasi.

Untuk dikodekan secara efektif dan ditranslasikan menjadi protein, suatu gen harus ditransfer ke dalam sel, yang secara alami mungkin mengandung semua faktor-faktor yang diper.lkan dalam proses transkripsi dan translasi. Ada berbagai teknik yang bisa digunakan untuk proses transfer gen, diantaranya: 1). Fusi sel; 2). Penggunaan senyawa kimia; 3). Elektroporasi; 4). Injeksi menggunakan vektor virus; 5) Mikroinjeksi.

Untuk lebih detail, dapat anda baca pada artikel Mengenal Teknik-Teknik Transfer Gen ke dalam Sel.


Artikel ini sebagian besar disarikan dari Houdebine, LM. 2003. Animal Transgenesis and Cloning. Wiley England.

Read More

Teknik PCR (Polymerase Chain Reaction)

Polymerase Chain Reaction atau PCR adalah teknik atau metode penggandaan (replikasi) DNA secara in-vitro. Teknik ini memungkinkan kita untuk melakukan replikasi DNA di luar sel atau tubuh organisme hidup. Melalui teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah melimpah dengan dalam waktu singkat sehingga bisa membantu pekerjaan peneliti atau bidang lainnya terkait dengan penggunaan DNA sebagai objek kajian. Misalnya untuk , penentuan strain atau spesies organisme tertentu, deteksi penyakit, deteksi atau kajian gen, terapi gen, serta di bidang forensik.Teknik ini pertama kali ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1983 sehingga beliau memperoleh hadiah Novel atas temuannya tersebut.

Reagen yang digunakan:
1. DNA target hasil ekstraksi. Berdasarkan pengalaman penulis, DNA tersebut dapat diencerkan 5-10X, sesuai kebutuhan.
2. Sepasang primer yang komplementer dengan DNA target. Primer merupakan fragmen DNA berukuran pendek dengan panjang 10-25 basa yang akan dijadikan sebagai mengawali proses replikasi DNA sekaligus membatasi daerah DNA yang akan diamplifikasi,
3. DNA polymerase. Enzim ini berperan dalam mengamplifikasi DNA sesuai dengan urutannya.
4. dNTP, terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa DNA, yaitu dATP,dGTP, dTTP, dan dCTP. Berfungsi sebagai building block DNA yang baru dibentuk.
5. Buffer PC R (KCl, Tris-HCL, MgCl2). Buffer ini berfungsi untuk menjaga kestabilan reaksi agar berjalan secara optimum.
6. ddH2O atau  nuclease free water (merk dagang).Berfungsi sebagai pelarut.

Pada saat  ini  sudah tersedia berbagai macam kit-PCR yang sudah mengandung reagen-reagen tersebut, kecuali primer dan DNA target tentunya, sehingga kita tidak perlu mencampurkanya satu persatu.

Prinsip Kerja
Secara prinsip, PCR merupakan reaksi berulang atau berantai yang melibatkan 20-40 siklus, tergantung kebutuhan, yang terdiri atas 3 tahap sebagai berikut:
1. Tahap denaturasi (melting), pada suhu 94-96oC.
Pada tahap ini, ikatan hidrogen terputus dan DNA untai ganda masing-masing terpisah menjadi untai tunggal. Pada proses replikasi DNA secara in-vivo, proses ini dibantu oleh sejumlah enzim seperti enzim helikase dan girase. Karena sifatnya yang unik, dimana DNA terdenaturasi pada suhu tinggi dan kemudian dapat terenaturasi kembali pada suhu rendah, maka sifat ini dijadikan dasar untuk tahap denaturasi proses PCR dengan menggunakan pemanasan. Pemisahan ini memungkinkan penempelan primer yang komplemen dengan DNA target pada sekuen yang sesuai. Durasinya berkisar 1-5 menit, tergantung kandungan basa GC dari sekuen DNAnya. Semakin tinggi GC nya, maka waktunya lebih lama. Sepertihalnya pernah disebutkan bahwa ikatan GC (3 ikatan hidrogen) lebih kuat dibandingkan dengan AT.
2. Tahap penempelan (annealing), pada suhu 45-60oc
Setelah DNA terdenaturasi, kemudian suhu diturunkan sehingga primer dapat menempel pada bagian DNA yang komplementer dengan urutan basanya. Penempelan tersebut sifatnya spesifik. Suhu annealing yang tidak cocok menyebabkan kegagalan dalam replikasi DNA yang benar. Suhu Annealing (TA) bisa dihitung berdasarkan suhu melting (TM). Jika suhunya terlalu tinggi dari yang seharusnya, maka primer tidak dapat menempel pada DNA cetakan, sementara jika suhunya terlalu rendah akan menyebabkan penempelan pada daerah atau sekuen DNA yang tidak sesuai.
3. Tahap pemanjangan (elongasi), pada suhu 72oC (opsional).
Pada tahapan ini, enzim DNA polymerase melakukan sintesis DNA dengan menambahkan pasangan basa yang tepat, satu demi satu secara cepat,  pada sisi 3’ primer yang telah menempel pada DNA cetakan. Suhu untuk tahap ini tergantung pada jenis enzim polimerase yang digunakan. Khusus untuk Taq Polimerase, 72oC adalah suhu yang biasa digunakan.

3 tahap reaksi PCR

Deteksi produk hasil PCR
Meskipun produk PCR berupa jutaan copy fragmen DNA, produk ini tidak tetap dapat dilihat dengan mata telanjang. Oleh karena itu, diperlukan teknik finishing untuk dapat memvisualisasikan produk hasil PCR ini. Salah satu teknik yang banyak digunakan untuk visualisasi DNA adalah dengan elektroforesin dengan menggunakan gel atau poliakrilamid.  Dengan visualisasi ini memungkinkan kita untuk menentukan ukuran band pita DNA yang muncul sehingga menunjukkan apakah produk PCR yang dihasilkan adalah benar dan sesuai dengan yang diinginkan.

artikel ini disarikan dari wikipedia dan sumber lain serta berdasarkan pengalaman penulis

Read More