Mengenal Teknik-Teknik Transfer Gen ke dalam Sel.

Mikroinjeksi

Pada artikel sebelumnya, Mengenal teknik-teknik dalam rekayasa genetika, telah dibahas berbagai macam teknik-teknik utama dalam rekayasa genetika. Salah satu teknik tersebut adalah bagaimana peneliti memungkinkan gen ditransfer secara efektif ke dalam sel. Pada dasarnya, teknik-teknik yang akan dibahas pada artikel ini, biasa digunakan untuk transfer gen ke dalam sel hewan.mikrobia maupun sel tanaman.  Khusus untuk transfer gen pada tanaman dapat anda baca pada artikel Teknologi Tanaman Transgenik.

Suatu gen hasil isolasi dapat ditranskripsi secara in-vitro dan mRNAnya juga dapat  ditranslasikan pada suatu sistem bebas sel. Teknik ini memungkinkan peneliti memperoleh sejumlah protein dalam jumlah kecil, yang mungkin tidak cukup untuk beberapa penelitian biokimia, atau untuk penentuan aktifitas biologi protein tersebut secara in vivo atau menentukan strukturnya melalui proses kristalisasi.

Untuk disandikan secara efektif dan ditranslasikan menjadi protein, suatu gen harus ditransfer ke dalam sel, yang secara alami mungkin mengandung semua faktor-faktor yang diper.lkan dalam proses transkripsi dan translasi.

Membran plasma pada berbagai jenis sel yang berbeda merupakan barier yang memungkinkan pengambilan senyawa secara selektif. Pada beberapa kasus, molekul masuk ke dalam sel melalui pori-pori yang terbuka dan tertutuo melalui suatu kontrol oleh sel. Senyawa-senyawa pembawa khusus juga dapat metranspor molekul-molekul untuk kemudian ditransfer ke dalam sel. Pada kasus yang lain, molekul mengenali reseptor-reseptor khusus di bagian luar membran plasma dan membentuk kompleks yang memodifikasi membran secara lokal, yang mengarhkan internalisasi kompleks serta membran yang mengelilinginya, Proses ini disebut endositosis.

DNA merupakan molekul bermuatan negatif dan berukuran besar. DNA tidak bisa melintasi membran plasma secara spontan. Mekanisme ini merupakan cara sel untuk melindungi diri dari DNA asing yang mungkin ada di sekitarnya, Oligonukleotida yang ditambahkan ke medium kultur sek atau diinjeksikan ke dalam hewan dapat memasuki sel pada kondisi dimana mereka ada dalam konsentrasi tinggi,

Ada berbagai teknik yang bisa digunakan untuk proses transfer gen, diantaranya: 1). Fusi sel; 2). Penggunaan senyawa kimia; 3). Elektroporasi; 4). Injeksi menggunakan vektor virus; 5) Mikroinjeksi.

A. Fusi sel

Sebuah plasmid dapat ditransfer dengan menggabungkan protoplas bakteri dengan sel yang akan ditransfeksikan. Metode ini sebenarnya tidak efesien dan jarang digunakan. Kekurangan lainnya adalah semua gen bakteri juga ikut ditransfer ke dalam sel.

Fusi sel bakteri dan yeast

B. Menggunakan senyawa kimia

Karena, penggabungan DNA secara in-vitro dengan berbagai molekul yang membentuk suatu kompleks yang memasuki sel bersifat efesien maka teknik ini paling umum digunakan, Salah satu molekul yang biasa digunakan adalah kalsium klorida. Gugus fosfat DNA terikat ke kalsium menghasilkan suatu kompleks tidak larut, yang berpresipitasi jika kelebihan kalsium dan fosfat ditambahkan ke DNA. Campuran tersebut ditambahkan ke dalam medium kultur. Sejumlah kecil compleks tidak laurt yang melingkupi sel kemudian di endositosis secara spontan. DNA kemudian dilarutkan ulang di dalam sitoplasma sel. Sebagian besar DNA yang masuk didegradasi dan sisanyabisa mencapai nukleus, dimana DNA tersebut  kemudian ditranskripsi.

Metode fisik

C. Elektroporasi

Metode ini dilakukan dengan menaruh sel ke medan listrik arus bolak balik. Hal ini menyebabkan pori sementara di dalam membran plasma. DNA yang ditambahakan pada medium elektroporasi dapat masuk ke dalam sel melalui pori. Medan listrik juga menginduksi mobilitas DNA dan memungkinkan pengambilannya oleh sel.  Metode ini sedikit efesien dan biasanya digunakan dengan jenis sel dimana penggunaan senyawa kimia kurang bisa dihandalkan, Sejumlah sel dihancurkan karena pengaruh medan elektrik tersebut, Sehingga teknik ini merupakan metode yang baik untuk menghasilkan klon dengan DNA yang benar-benar terintegrasi. Elektroporasi dalam teknik terbaik untuk transfer gen ke dalam sel punca embrionik  (embrionic stem cell) dan menempatkan suatu gen endogen melalui rekombinasi homolog.

Transfer gen dengan elektroporasi

D. Infeksi dengan vektor virus

Berbagai vektor virus digunakan untuk mentrasfer gen ke dalam sel. Beberapa gen esensial dihapus dari genom virus. Delesi ini menghasilkan genom virus mampu atau tidak mampu ber replikasi secara otomatis. Hal ini juga membuat ruang di dalam genom virus untuk kemudian disisipkan gen asing. Genom hasil rekombinasi ini sudah tidak mampu menghasilkan partikel virus fungsional, karena protein virus yang esensial sudah hilang. Genom virus hasil rekombinasi tersebut harus ditransfer ke dalam sel yang kemudian diekspresikan secara sementara atau secara stabil. Sel hasil transformasi ini kemudian mampu mensintesis partikel virus yang mengandung gen asing. 

Transfer gen dengan vektor virus

E. Mikroinjeksi

DNA di dalam larutan dpat dimikroinjeksikan secara langsung ke dalam sitoplasma sel atau nukleus. Teknik ini sulit dan membutuhkan persyaratan khusus (mikroskop dan mikroinjektro) dan latihan khusus.

Teknik transfer gen dengan mikroinjeksi

Artikel ini sebagian besar disarikan dari Houdebine, LM. 2003. Animal Transgenesis and Cloning. Wiley England.

Read More

Mengenal Teknik-teknik dalam Rekayasa Genetika

Rekayasa genetika adalah kegiatan manipulasi gen dengan teknik DNA rekombinan dengan tujuan mengubah, menghilangkan atau memunculkan ekspresi gen tersebut pada suatu organisme hidup.  Obyek rekayasa genetika mencakup hampir semua golongan organisme, mulai dari bakteri, alga,  fungi, tumbuh-tumbuhan,  hewan tingkat rendah, dan hewan tingkat tinggi. 

Ada beberapa tahapan utama dalam rekayasa genetika, yaitu:

1. Kloning gen
Kloning gen terdiri atas beberapa tahapan, diantaranya memotong DNA  menjadi fragmen-fragmen dengan ukuran beberapa ratus hingga ribuan kb (kilobase), selanjutnya fragmen ini dimasukkan ke dalam vektor bakteri untuk kloning. Berbagai macam vektor didesain untuk membawa DNA dengan panjang yang berbeda. Plasmid, kosmid, faga P1, BAC (bacterial artificial chromosome), dan YAC (Yeast Artificial Chromosome) dapat membawa DNA hingga 20 kb, 40 kb, 90 kb, 200 kb, dan 1000 kb secara berturut-turut. Setiap vektor, hanya mengandung satu fragmen DNA, dimasukkan ke dalam bakteri, yang kemudian teramplifikasi, membentuk suatu klon. Sejumlah besar setiap fragmen DNA kemudian diisolasi dari setiap klon. Ekspresi kloning gen telah disimpan dengan perbanyakan kloning yang dilakukan pada bakteri yang mengandung fragmen DNA tersebut.

Teknik Kloning Gen

Kloning fragmen DNA secara langsung  yang mengandung gen tertentu seringkali tidak bisa dilakukan. Kloning cDNA yang tepat biasanya merupakan tahapan intermediat atau pertengahan. Untuk tujuan ini, mRNA suatu jenis sel diretrotranskripsi menjadi DNA menggunakan enzim reverse-transkriptase virus. DNA untai tunggal yang dihasilkan dengan caran ini kemudian diubah mejadi DNA untai ganda menggunakan DNA polimerase. Fragmen DNA yang dihasilkan selanjutnya dikloning ke dalam plasmid untuk menghasilkan bank cDNA.

2. Sequensing DNA
Sekuensing DNA terdiri atas penentuan urutan basa suatu fragmen DNA. Selama bertahun-tahun  sekuensing dilakukan dengan teknik yang butuh waktu dan proses lama. Sekarang proses ini bersifat automatis dan dilakukan dalam skala industri dan memungkinkan mensekuensing beberapa ribu kilobasa per hari.

3. Amplifikasi gen secara in-vitro
Teknik yang dikenal sebagai PCR (polymerase chain reaction) untuk amplifikasi DNA ini paling sering digunakan oleh praktisi biologi molekuler Teknik PCR mensintesis untaian komplementer suatu fragmen DNA yang dimulai dengan suatu primer. Untuk lebih jelasnya dapat dibaca pada artikel Mengenal Teknik PCR (Polymerase Chain Reaction).

4. Konstruksi Gen
Penelitian gen seringkali membutuhkan konstruksi gen fungsional yang dimulai dari berbagai elemen gen. Elemen-elemen ini mungkin daerah regulator atau mungkin daerah transkrip. Mereka bisa saja dalam struktur asli atau hasil mutasi dengan eksperimen. Konstruksi gen dapat membantu identifikasi daerah regulator yang mengontrol ekspresi gen. Daerah koding atau coding region mungkin mengandung struktur aslinya. Konstruk gen bisa digunakan untuk mengkaji pengaruh gen pada sel atau organisme secara menyeluruh. Daerah transkrip mungkin mengandung suatu gen reporter yang menyandi protein yang bisa dengan mudah divisualisasi atau dikuantifikasi berdasarkan aktifitas spesifik enzimnya.

Rekayasa genetika mungkin dapat digunakan pada skala industri untuk memprogram ulang sel atau organisme untuk menghasilkan rekombinan sifat terkait farmasi dan untuk mencegah  respon penolakan imun pada sel atau organ hasil transplantasi.

Berbagai metode ekspresi gen (Sumber: Houdebine, 2003)

Pada semua kasus, gen harus dikonstruksi secara eksprimen. Konstruks gen mengandung sedikitnya daerah promoter, daerah transkrip, dan daerah terminator. Dengan demikian, suatu konstruk gen kemudian bisa disebut sebagai vektor ekspresi.

Konstruksi gen mengimplikasikan penggunaan enzim restriksi yang memotong DNA pada daerah spesifik, sintesis oligonukleotida secara kimiawi, amplifikasi fragmen DNA secara in-vitro menggunakan teknik PCR, serta menyambungkan fragmen DNA yang berbeda dengan ikatan kovalen menggunakan enzim ligase. Sebagian besar, fragmen ini ditambahkan pada plasmid yang kemudian ditransfer ke dalam bakteri. Klon bakteri kemudian diselksi dan diamplifikasi.

Pemilihan elemen yang ditambahkan pada konstruk tergantung pada tujuan eksperimen dan khususnya pada jenis sel dimana konstruk tersebit akan diekspresikan. Kode genetik bersifat universal, bahkan jika beberapa kodon sering digunakan secara efektif pada jenis sel tertentu dibandingkan sel lain. Kode yang menentukan aktifitas sekuen regulator bersifat spesifik bagi setiap organisme. Promoter dari suatu gen bakteri tidak akan aktif pada sel tumubuhan maupun hewan, begitu pula sebaliknya.

5. Transfer gen ke dalam sel

Suatu gen hasil isolasi dapat ditranskripsi secara in-vitro dan mRNAnya juga dapat  ditranslasikan pada suatu sistem bebas sel. Teknik ini memungkinkan peneliti memperoleh sejumlah protein dalam jumlah kecil, yang mungkin tidak cukup untuk beberapa penelitian biokimia, atau untuk penentuan aktifitas biologi protein tersebut secara in vivo atau menentukan strukturnya melalui proses kristalisasi.

Untuk dikodekan secara efektif dan ditranslasikan menjadi protein, suatu gen harus ditransfer ke dalam sel, yang secara alami mungkin mengandung semua faktor-faktor yang diper.lkan dalam proses transkripsi dan translasi. Ada berbagai teknik yang bisa digunakan untuk proses transfer gen, diantaranya: 1). Fusi sel; 2). Penggunaan senyawa kimia; 3). Elektroporasi; 4). Injeksi menggunakan vektor virus; 5) Mikroinjeksi.

Untuk lebih detail, dapat anda baca pada artikel Mengenal Teknik-Teknik Transfer Gen ke dalam Sel.


Artikel ini sebagian besar disarikan dari Houdebine, LM. 2003. Animal Transgenesis and Cloning. Wiley England.

Read More