Reagen yang digunakan:
1. DNA target hasil ekstraksi. Berdasarkan pengalaman penulis, DNA tersebut dapat diencerkan 5-10X, sesuai kebutuhan.
2. Sepasang primer yang komplementer dengan DNA target. Primer merupakan fragmen DNA berukuran pendek dengan panjang 10-25 basa yang akan dijadikan sebagai mengawali proses replikasi DNA sekaligus membatasi daerah DNA yang akan diamplifikasi,
3. DNA polymerase. Enzim ini berperan dalam mengamplifikasi DNA sesuai dengan urutannya.
4. dNTP, terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa DNA, yaitu dATP,dGTP, dTTP, dan dCTP. Berfungsi sebagai building block DNA yang baru dibentuk.
5. Buffer PC R (KCl, Tris-HCL, MgCl2). Buffer ini berfungsi untuk menjaga kestabilan reaksi agar berjalan secara optimum.
6. ddH2O atau nuclease free water (merk dagang).Berfungsi sebagai pelarut.
Pada saat ini sudah tersedia berbagai macam kit-PCR yang sudah mengandung reagen-reagen tersebut, kecuali primer dan DNA target tentunya, sehingga kita tidak perlu mencampurkanya satu persatu.
Prinsip Kerja
Secara prinsip, PCR merupakan reaksi berulang atau berantai yang melibatkan 20-40 siklus, tergantung kebutuhan, yang terdiri atas 3 tahap sebagai berikut:
1. Tahap denaturasi (melting), pada suhu 94-96oC.
Pada tahap ini, ikatan hidrogen terputus dan DNA untai ganda masing-masing terpisah menjadi untai tunggal. Pada proses replikasi DNA secara in-vivo, proses ini dibantu oleh sejumlah enzim seperti enzim helikase dan girase. Karena sifatnya yang unik, dimana DNA terdenaturasi pada suhu tinggi dan kemudian dapat terenaturasi kembali pada suhu rendah, maka sifat ini dijadikan dasar untuk tahap denaturasi proses PCR dengan menggunakan pemanasan. Pemisahan ini memungkinkan penempelan primer yang komplemen dengan DNA target pada sekuen yang sesuai. Durasinya berkisar 1-5 menit, tergantung kandungan basa GC dari sekuen DNAnya. Semakin tinggi GC nya, maka waktunya lebih lama. Sepertihalnya pernah disebutkan bahwa ikatan GC (3 ikatan hidrogen) lebih kuat dibandingkan dengan AT.
2. Tahap penempelan (annealing), pada suhu 45-60oc
Setelah DNA terdenaturasi, kemudian suhu diturunkan sehingga primer dapat menempel pada bagian DNA yang komplementer dengan urutan basanya. Penempelan tersebut sifatnya spesifik. Suhu annealing yang tidak cocok menyebabkan kegagalan dalam replikasi DNA yang benar. Suhu Annealing (TA) bisa dihitung berdasarkan suhu melting (TM). Jika suhunya terlalu tinggi dari yang seharusnya, maka primer tidak dapat menempel pada DNA cetakan, sementara jika suhunya terlalu rendah akan menyebabkan penempelan pada daerah atau sekuen DNA yang tidak sesuai.
3. Tahap pemanjangan (elongasi), pada suhu 72oC (opsional).
Pada tahapan ini, enzim DNA polymerase melakukan sintesis DNA dengan menambahkan pasangan basa yang tepat, satu demi satu secara cepat, pada sisi 3’ primer yang telah menempel pada DNA cetakan. Suhu untuk tahap ini tergantung pada jenis enzim polimerase yang digunakan. Khusus untuk Taq Polimerase, 72oC adalah suhu yang biasa digunakan.
 |
| 3 tahap reaksi PCR |
Deteksi produk hasil PCR
Meskipun produk PCR berupa jutaan copy fragmen DNA, produk ini tidak tetap dapat dilihat dengan mata telanjang. Oleh karena itu, diperlukan teknik finishing untuk dapat memvisualisasikan produk hasil PCR ini. Salah satu teknik yang banyak digunakan untuk visualisasi DNA adalah dengan elektroforesin dengan menggunakan gel atau poliakrilamid. Dengan visualisasi ini memungkinkan kita untuk menentukan ukuran band pita DNA yang muncul sehingga menunjukkan apakah produk PCR yang dihasilkan adalah benar dan sesuai dengan yang diinginkan.
artikel ini disarikan dari wikipedia dan sumber lain serta berdasarkan pengalaman penulis
0 komentar:
Posting Komentar