Mengungkap Komunitas Bakteri secara Molekuler: Teknik PCR-RISA

Analisis komunitas bakteri dilakukan untuk melihat keragaman komunitas bakteri di suatu sampel atau lingkungan tertentu, misalnya pada tanah, air,  buah, akar tanaman, atau pada kotoran ternak. Analisis ini biasanya dilakukan oleh para peneliti untuk melihat pengaruh senyawa maupun polutan tertentu terhadap struktur komunitas bakteri yang ada suatu tanah maupun lingkungan perairan.

Ada beberapa teknik  yang dapat dilakukan untuk melihat keragaman komunitas bakteri, baik secara kultur-dependen maupun kultur-independen (Jin et al., 2011; Fujita et al., 2010). Keterbatasan utama dari kultur-dependen adalah >99% mikrobia tidak dapat ditumbuhkan dengan teknik kultur standar  (Hugenholtz, 2002). Oleh karena itu pada kultur-independen marker yang digunakan umumnya berupa biomolekul seperti asam nukleat, lipid maupun protein (Rastogi & Sani, 2011).

Teknik molekuler dapat digunakan baik untuk pendekatan kultur-dependen maupun kultur-independen  (Fakruddin & Mannan, 2013). Secara luas, teknik ini dikelompokkan menjadi dua kategori utama, tergantung kemampuannya dalam mengungkap struktur dan fungsi diversitas bakteri (1) pendekatan analisis komunitas secara menyeluruh, meliputi hibridisasi DNA, sekuensing genom lengkap, metagenom, proteogenom, dan metatranskriptom (2) pendekatan analisis komunitas secara parsial; meliputi teknik fingerprinting (DGGE/TTGE, SSCP, RAPD, ARDRA, T-RFLP, LH-PCR, RISA, and RAPD), perpustakaan klon (clone library), Quantitatif-PCR, hibridisasi fluoresens-in situ, dan analisis lipid bakteri (Rastogi & Sani, 2011).

 Teknik PCR-RISA (Polymerase Chain Reaction-Ribosomal Intergenic Spacer Analysis)

Pada teknik RISA (Ribosomal Intergenic Spacer Analysis), daerah ISR (intergenic spacer region) antara 16S dan 23S rRNA diamplifikasi dengan PCR, didenaturasi dan dipisahkan pada gel poliakrilamid atau agarose dibawah kondisi terdenaturasi (Kirk et al., 2004). Daerah ini mungkin mengkode tRNA dan berguna untuk membedakan strain bakteri dan spesies yang berkerabat dekat karena heterogenitas panjang dan urutan ISRnya (Fisher & Triplett, 1999).

Intergenic Spacer Region ( ISR) (150-1500 bp)

 

  

Posisi daerah ISR pada gen 16s dan 23S rRNA. (Sumber: Biominewiki);  

 Daerah ISR mengandung heterogenitas yang penting baik panjang maupun urutannya. Dengan menggunakan primer yang menempel ke daerah konservatif di antara gen 16S dan 23S rRNA, profil RISA dapat dihasilkan dari bakteri yang hidup dominan di suatu sampel atau lingkungan. RISA menyediakan profil komunitas yang spesifik, dimana setiap pita menunjukkan setidaknya satu organisme dalam komunitas (Rastogi & Sani, 2006).

 Aplikasi, Kelebihan, serta Kelemahan PCR-RISA

RISA digunakan secara luas untuk analisis komunitas mikrobia berbagai macam sampel di lingkungan yang berbeda-beda. Risa telah dieksplorasi untuk membandingkan diversitas mikrobia di dalam tanah, di dalam rizosfer tanaman (Benizri et al., 2005), pada tanah yang terkontaminasi (Ranjard et al., 2000) , dan respon terhadap inokulasi (Rojaz-oropeza et al., 2010). Selain itu RISA juga telah diaplikasikan untuk studi dinamika mikrobia dalam bioreaktor (Qu et al., 2009) serta analisa sampel sputum untuk pengkajian penyakit (Nazaret et al., 2009).

Meskipun RISA memberikan estimasi komposisi komunitas mikrobia yang relatif cepat, secara teknis RISA membutuhkan kuantitas DNA yang besar. Selain itu visualisasi produk PCR-RISA menggunakan elektroforesis gel agarose dan poliakrilamid tidak praktis dan efesien dari segi waktu (Fisher & Triplett, 1999).

sumber: S. Ahmad Tahir