Aplikasi Bioteknologi dalam Bidang Pertanian

Akhir-akhir ini bioteknologi sering menjadi bahan diskusi seperti halnya penelitian biomedis, meskipun ada kelompok industri yang memperoleh keuntungan dari bioteknologi terkait penelitian, kloning dan rekayasa gen. Banyak orang yang kemudian dikenal atas argumen mereka terkait penggunaan GMO  (Genetically Modified Organism) sebagai bahan makanan. Industri pertanian berada di tengah-tengah perdebatan tersebut dan bioteknologi pertanian telah memproduksi produk-produk baru yang tak terhitung jumlahnya, dimana produk tersebut memiliki kemungkinan untuk bisa mengubah hidup kita menjadi lebih baik.

1 Vaksin
Vaksin oral sudah banyak digunakan sebagai solusi atas meningkatnya paparan penyakit di negara-negara miskin dan berkembang, di mana biaya untuk vaksinasi secara ekstensif cukup besar. Tanaman hasil rekayasa, sering buah atau sayuran, diharapkan membawa protein antigenik dari patogen yang akan mengaktifkan sistem kekebalan tubuh ketika disuntikkan.

Contohnya yaitu vaksin untuk mengobati kanker. Sebuah vaksin anti-limfoma telah dibuat menggunakan tanaman tembakau yang membawa RNA dari sel-B maglinan hasil klon. Protein yang dihasilkan selanjutnya digunakan untuk memvaksinasi pasien dan meningkatkan sistem kekebalan tubuh mereka terhadap kanker. Vaksin yang dibuat khusus untuk pengobatan kanker cukup menjanjikan dalam berbagai penelitian pendahuluan.

2 Antibiotik
Pada kasus ini, tanaman digunakan untuk membuat antibiotik, baik untuk manusia dan hewan. Suatu protein antibiotik hasil ekspresi dalam pakan ternak, yang dipakankan langsung ke hewan, lebih murah dibanding produksi antibiotik tradisional, tetapi praktik ini menimbulkan banyak masalah bioetika, karena hasilnya tersebar luas, penggunaan antibiotik yang mungkin tidak perlu yang dapat mendorong pengembangan strain bakteri yang resisten antibiotik. Beberapa manfaat yang mungkin dapat dipetik dari penggunaan tanaman untuk menghasilkan antibiotik bagi manusia adalah dari segi biaya karena sejumlah besar produk dapat dihasilkan dari tanaman dibandingkan penggunaan teknik fermentasi, purifikasi yang lebih mudah, dan resiko kontaminasi yang lebih kecil dibandingkan dengan sel mamalia dan media kultur.

3 Bunga
Ada manfaat lebih pada bioteknologi pertanian selain untuk pengendalian penyakit atau peningkatan kualitas makanan. Salah satunya adalah terkait estetika dengan menggunakan teknik transfer gen untuk merekayasa dengan meningkatkan warna, bau, ukuran dan serta sifat unik bunga lainnya. Dengan cara yang sama biotek telah digunakan dalam pengembangan tanaman hias lainnya, khususnya tanaman semak dan pohon. Contoh unik lainnya adalah peningkatan ketahanan tanaman tropis terhadap suhu rendah, sehingga dapat ditanam di daerah utara atau beriklim subtropis dan dingin.

4. Biofuels
Melalui aplikasi biotek pertanian, petani dapat meningkatkan hasil pertaniannya sekaligus mengurangi penggunaan pestisida. Generasi kedua biofuel yang telah diproduksi dalam skala laboratorium memungkinkan penggunaan tanamanan untuk menghasilkan etanol atau bahan bakar unggul dalam jumlah yang lebih besar dengan emisi karbon kecil. Keuntungan yang diperoleh dari biofuel dalam menambah cadangan bahan bakar dengan sedikit sumbangan pada perubahan iklim tergantung pada pemanfaatan potensi biotek pertanian secara efektif.

5. Tanaman dan Reproduksi Hewan
Meningkatkan tanaman dan perilaku hewan dengan metode tradisional seperti penyerbukan silang, okulasi, dan persilangan memakan waktu. Biotech modern memungkinkan perubahan tertentu yang dibuat secara cepat, pada tingkat molekuler melalui over-ekspresi atau delesi gen, atau insersi gen asing.

Yang terakhir adalah penggunaan mekanisme kontrol ekspresi gen, seperti promotor gen spesifik dan faktor transkripsi. Metode seperti seleksi yang dibantu dengan marker meningkatkan efisiensi persilangan hewan, tanpa kontroversi yang biasanya terkait dengan GMO. Metode  kloning gen juga harus memperhatikan perbedaan spesies dalam hal kode genetik, ada atau tidak adanya intron dan modifikasi pasca-translasi seperti metilasi.

6 Tanaman Resistant Pestisida
Tanaman resisten pestisida memungkinkan petani untuk membunuh gulma di sekitar tanaman pangan secara selektif tanpa merugikan mereka. Contoh yang paling terkenal adalah teknologi Roundup-Ready yang diproduksi oleh Monsanto.

Pertama kali diperkenalkan pada tahun 1998 sebagai kedelai hasil modifikasi genetik, tanaman Roundup-Ready tidak terpengaruh oleh herbisida yang dapat diterapkan dalam jumlah berlebihan untuk menyingkirkan setiap tanaman lain di lapangan. Keuntungannya adalah penghematan waktu dan biaya  terkait pengolahan tanah secara konservatif untuk mengurangi gulma, atau beberapa aplikasi dari berbagai jenis herbisida untuk menghilangkan spesies gulma spesifik secara selektif Namun, kelemahannya mencakup semua perdebatan kontroversial terkait GMO.

7 Nutrisi Suplementasi
Dalam rangka meningkatkan kesehatan manusia, terutama di negara-negara yang berkembang, para ilmuwan menciptakan makanan yang secara turun temurun memiliki defisiensi terhadap nutrisi tertentu, untuk membantu melawan penyakit atau kelaparan. Contoh dari hal ini adalah Golden Rice, yang mengandung beta-karoten, prekursoruntuk pabrik Vitamin A di dalam tubuh kita. Orang yang makan nasi tersebut menghasilkan lebih banyak vitamin A, dan nutrisi penting yang kurang dalam diet masyarakat miskin di negara-negara Asia.

Tiga gen, dua dari bunga dafodil dan satu dari bakteri, yang mengekspresikan enzin yang berperan dalam empat reaksi biokimia, diklon ke beras untuk membuatnya bersifat"golden". Nama tersebut berasal dari warna gandum transgenik karena yang mengekspresikan beta-karoten secara berlebihan, yang juga memberikan warna oranye pada wortel.

8 Strain konfrontasi biotik
Sebuah jumlah yang lebih rendah dari dari 20% dari bumi adalah tanah yang subur tetapi beberapa tanaman telah turun temurun diubah untuk membuat mereka lebih liberal dari kondisi seperti salinitas, dingin dan kekeringan. Deteksi gen pada tanaman yang bertanggung jawab untuk penyerapan natrium telah menyebabkan pertumbuhan knock-out tanaman dapat tumbuh dalam lingkungan garam yang tinggi. Up atau down-regulasi record biasanya metode yang digunakan untuk mengubah kekeringan toleransi pada tanaman. Jagung dan rapeseed tanaman, mampu berkembang dalam kondisi kekurangan, dalam tahun keempat mereka uji coba lapangan di California dan Colorado, dan dapat diprediksi bahwa mereka akan mencapai pasar dalam 4-5 tahun.

9. Industri Serat kuat
Sutra laba-laba adalah serat terkuat yang dikenal manusia, lebih kuat dari kevlar (digunakan untuk membuat rompi tahan peluru), dengan daya tarik yang lebih daripada baja. Pada bulan Agustus 2000, perusahaan Kanada Nexia mengumumkan hewan hasil modifikasi  genetik berupa kambing transgenik yang membentuk protein sutra laba-laba dalam susu mereka. Sementara ini memecahkan kesulitan produksi protein secara massal, agenda itu dikesampingkan ketika para ilmuwan tidak bisa mencari cara untuk memintal mereka menjadi serat seperti yang dilakukan oleh laba-laba.

Artikel ini diterjemahkan dan disarikan dari:
www.biotechonweb.com
agbioforum

Read More

Teknologi Tanaman Transgenik

Pemuliaan tanaman dengan teknik seleksi dan hibridisasi memiliki banyak keterbatasan, terutama karena ketidakmampuan teknik ini untuk menembus barrier reproduksi, sehingga sifat yang diperoleh berasal dari spesies itu sendiri. Untuk itu, muncullah teknologi transgenik dengan memanfaatkan DNA rekombinan yang kemudian ditransformasikan ke dalam sel tanaman yang selanjutnya dikultur menjadi tanaman transgenik yang utuh dan baru. Untuk menghasilkan tanaman transgenik, ada beberapa langkah utama yang dilakukan, yaitu:

1.      Isolasi gen

2.      Menyiapkan jaringan (kultur jaringan)     

3.      Transformasi

4.      Regenerasi

Pada artikel ini, pembahasan akan lebih ditekankan pada tahap transformasi vektor yang membawa gen ke dalam sel tanaman.

Metode Transformasi Genetik pada Tanaman

Ada beberapa metode yang dapat digunakan untuk transformsi gen ke dalam tanaman, dan yang umum digunakan  yaitu partikel bombardment dan melalui pertantara Agrobacterium tumefaciens.

1.      Partikel Bombardment

Helios Gen Gun dan alat Gen Gun Standar

Partikel bombardment merupakan salah satu teknik yang digunakan untuk memasukkan DNA asing ke dalam kultur sel dengan cara penembakan. Melalui teknik ini, gen asing ditransfer secara langsung ke dalam sel atau jaringan, dengan daerah kisaran yang luas. Partikel Bombardmen juga dikenal sebagai gen gun (senapan gen) atau biolistik (Anonim, 2009). Teknik partikel bombardent sekarang sudah luas digunakan, tidak hanya untuk produksi tanaman transgenik tetapi juga digunakan pada sel bakteri dan hewan bahkan ke dalam organ hewan yang masih hidup. Para saintis telah memodifikasi alat ini sehingga dapat mentransfer DNA ke dalam mitokondria yeast, kloroplas dan mikroalga hijau (Clark, 2012: 406).  

Gen terkandung dalam plasmid ataupun dalam kaset gen (fragmen linear gen hasil PCR). Pada plasmid terdapat marker khusus, promoter, sekuen gen dan terminator sedangkan kaset gen terdiri atas promoter, primer, probe, sekuen gen, terminator. Transformasi menggunakan partikel bombardment dapat dilakukan dengan lebih dari satu plamid yang membawa gen berbeda untuk berintegrasi dalam genom tumbuhan yang sama, contohnya gen yang mengkode PHA untuk jalur metabolit (Romano, dkk,. 2003). 

Skema Kaset gen

Teknik kerja partikel bombardment

Pada teknik bombardment, DNA dibawa oleh partikel logam emas atau tungsten yang berukuran mikroskopik. Partikel yang digunakan untuk bombardment biasanya berupa emas karena bersifat inert, padat, dan tidak beracun dalam sel. Partikel emas lebih aman untuk digunakan karena tungsten dapat bersifat toksik pada beberapa tanaman. Partikel yang membawa DNA  ditembakkan oleh senapan (gun) ke dalam jaringan tanaman dan menembus dinding sel untuk masuk ke dalam nukleus, mitokondria atau kloroplas dan menyatu dengan kromosom DNA inang. DNA vektor/plasmid membawa sekuen spesifik yang digunakan untuk mengenali lokasi yang tepat atau yang diinginkan untuk berintegrasi dengan genome (Hayes dan Frieda, 2010).  

Clark (2012) menyebutkan bahwa gen gun dapat beroperasi melalui 2 cara yaitu dengan pemberian tekanan udara maupun tegangan voltase yang tinggi.

Tipe Gen Gun. A. tekanan udara; B. tegangan voltase tinggi

DNA melepaskan diri dari partikel di dalam sel. Beberapa DNA masuk ke dalam organel target dan berhasil berintegrasi dengan kromosom DNA inang. Kemudian sel/jaringan transgen ditumbuhkan dalam medium kultur kusus sesuai dengan DNA yang membawa penanda kusus, misalnya gen resisten herbisida atau insektisida, gen yang dapat mendegradasi mercuri. Hasil kultur dianalisis untuk mengetahui hasil ekspresi DNA asing. Teknik analisis untuk mengetahui ekspresi transgen dilakukan melalui analisis sourthen blotting atau PCR (Romano, dkk., 2003).  

Faktor-faktor keberhasilan

Ada beberapa variabel yang harus dikontrol agar tingkat keberhasilan transformasi efektif, meliputi

1. Temperatur, jumlah sel dan kemampuan regenerasi sel atau totipotensi yang digunakan. Eksplant yang digunakan lebih baik eksplant yang masih memiliki kemampuan mersitematis, misalnya jaringan embrional dan epikotil  (Indurker, 2006).    .
2. Jumlah DNA yang menyelubungi partikel logam yang ditransfer ke dalam sel/jaringan (Eisenbraun, 1993)
3. Tipe senapan yang digunakan, jenis microcarrier, pemberian tekanan helium  (Indurker, 2006).   

Keuntungan

1. Gen gun dapat digunakan pada jangkauan yang lebih luas, misalnya pada tumbuhan dapat digunakan organ daun. Bakteri atau virus tidak dapat mentransfer gen ke dalam kloroplas sehingga metode gen gun dapat digunakan untuk memasukkan DNA asing ke dalam kloroplas.
2. Transformasi genetik lebih sederhana, cepat, dan memberikan frekuensi hasil transforman yang lebih tinggi dibandingkan menggunakan Agrobacterium. Transformasi menggunakan Agrobacterium pada buncis memiliki frekuensi hasil transformasi rata-rata 0.5-3%, sedangkan menggunakan partikel bombardment yaitu 18% (Indurker, 2006).   

Keterbatasan

Keterbatasan transformasi menggunakan partikel bombardment dibandingkan Agrobacterium yaitu

1. Harga alat dan perlengkapannya cukup mahal
2. Penembusan partikel ke dalam jaringan cukup dangkal
3. Daerah penembusan DNA plasmid ke dalam jaringan target cukup luas sehingga DNA yang ditransfer ke dalam sel acak. Beberapa sel yang tidak mengekspresikan transgen, akan mati jika ditumbuhkan dalam medium kultur kusus (Clark, 2012: 405).
4. Seringkali terjadi penggabungan salinan ganda transgen pada sisi tunggal penyisipan, penyusunan ulang gen yang menyisip dan penggabungan transgen pada sisi penyisipan ganda. Salinan ganda dapat menyebabkan hilangnya transgen pada keturunan berikutnya (Yao dkk., 2006).
5. Salah satu permasalahan dalam semua metodologi transformasi yang digunakan dan pada penggunaan partikel bombardment sendiri adalah tidak ada jaminan terekspresinya transgen oleh tanaman. Epigenetik dan efek posisi, gen silencing, fenomena supresi dan co-supresi seringkali menginaktifkan transgen (Romano, dkk., 2003). 

2.    Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium adalah genus dari bakteri gram negatif yang ditemukan oleh H.J.Conn yang digunakan untuk transfer gen secara horizontal yang menyebabkan tumor. Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri patogen pada tanaman yang banyak digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk menghasilkan suatu tanaman transgenik. Secara alami, A. tumefaciens dapat menginfeksi tanaman dikotil melalui bagian tanaman yang terluka sehingga menyebabkan crown gall tumor. Bakteri yang tergolong ke dalam gram negatif ini memiliki sebuah plasmid besar (lebih dari 200 kb) yang disebut plasmid-Ti yang berisi gen penyandi faktor virulensi penyebab infeksi bakteri ini pada tanaman. Untuk memulai pembentukan tumor, A. tumefaciens harus menempel terlebih dahulu pada permukaan sel inang dengan memanfaatkan polisakarida asam yang akan digunakan untuk melakukan kolonisasi pada sel tanaman. Selain tanaman dikotil, tanaman monokotilseperti jagung, gandum, dan tebu telah digunakan untuk memasukkan sel asing ke dalam genom tanaman.

  Tumor yang disebabkan oleh Agrobacterium

Plasmid Ti adalah vektor alami yang digunakan untuk mentransfer DNA ke dalam sel tanaman. Pada sebagian besar plasmid Ti, terdapat empat  kompleks gen, yaitu T-DNA (bagian yang ditransfer dan menyatu dengan genom tanaman,  gen virulen (vir) yang terdiri dari 50 kilo-basa untuk mengatur proses transfer T-DNA ke dalam DNA tanaman, gen tra/trb yang mengatur perpindahan plasmid Ti antarbakteri (conjugative transfer), bagian yang mengatur sistem replikasi plasmid (ORI), dan bagian gen yang menyandikan katabolisme opine.  Molekul opin ini akan dihasilkan oleh jaringan tanaman yang terinfeksi bakteri pembawa plasmid Ti dapat berupa octopine, nopaline, succinamopine and leucinopine. Plasmid Ti ini memiliki 196 gen yang dikode oleh 195 protein, memiliki panjang 206,479 nukleotida, kandungan GC 56% dan 81% material yang dikode oleh gen.

 Peta Ti plasmid Agrobacterium tumefaciens

Daerah virulensi (virulence region) terdiri gen virABCDEFG yang mengkode suatu enzim yang bertanggung jawab untuk mentransfer T-DNA ke dalam sel tumbuhan, yaitu

·      virA mengkode reseptor (transmembrane dimeric sensor protein) yang beraksi ketika adanya senyawa phenolic berupa acetosyringone,  syringealdehyde atau acetovanillone yang dikeluarkan dari kerusakan jaringan tumbuhan.

·         virB mengkode protein yang menghasilkan struktur seperti pilus

·         virC berikatan dengan enhancer pada T-region

·         virD1 dan virD2 mengenali T-DNA border dan menghasilkan endonuklease yang memotong (nicking) ujung kiri dan ujung kanan dari T-DNA yang dimulai dari ujung kanan

·         virG adalah faktor transkripsi (trancriptional factor) yang mengaktifkan ekspresi gen Vir setelah berikatan dengan sekuens yang cocok.

 Pada kromosom Agrobacterium setiap elemen gen menunjukkan peranan yang berbeda untuk perlekatan A. Tumefaciens ke sel tumbuhan. Lokus chvA dan chvB terlibat dalam sintesis dan ekskresi β 1,2 glucan (Cangelosi et al., 1989), chvE dibutuhkan dalam pengenalan gula dari induksi gen vir dan untuk kemotaksis bakteri tersebut (Ankenbauer et al., 1990, Cangelosi et al., 1991), lokus cel bertanggung jawab untuk sintesis fibril selulosa (Matthysse 1983), lokus pscA (exoC) berperan dalam siklus glucan dan asam sukkinoglikan (Cangelosi et at., 1991), dan lokus att yang terlibat dalam pembentukan protein permukaan sel bakteri (Matthysse, 1987).

Di alam, Agrobacterium tertarik pada tumbuhan yang memiliki luka kecil yang mengeluarkan senyawa phenolik seperti acetosyringone dan gula. Senyawa ini menginduksi bakteri untuk berpindah dan melekat pada tumbuhan melalui berbagai macam receptor permukaan sel. Induser yang sama mengaktifkan ekpresi gen vir yang terdapat pada Ti plasmid yang bertanggung jawab untuk transfer ss- DNA menuju sel tumbuhan.  Ini di bawah kendali dua komponen sistem regulasi yaitu virA protein yang mengenali acetosyringone yang dikode oleh gen virA di dalam Ti-plasmid dan chvE protein yang mengenali gula yang dikode di dalam kromosom bakteri . Senyawa-senyawa tersebut mengeluarkan signal yang dikenali oleh reseptor dimeric transmembran kompleks virA chvE. Pada permukaan sel, sensor melakukan aktivasi Vir A dengan cara autophosphorilasi ketika mendeteksi senyawa phenolic tumbuhan. Selanjutnya Vir A akan mengirimkan phosfat untuk pengikatan DNA oleh protein Vir G sebagai faktor transkripsi yang mengaktifkan proses transkripsi gen vir pada plasmid Ti yang akan mengekpresikan virC, virD, virE, virB, virF dan virH. Dua gen yang dihasilkan  VirD1 dan VirD2 yang mengenali 25 pb pada kedua ujung T-DNA  yang kemudian memotongnya (nicking)  membentuk kompleks untai tunggal T yang belum matang (immmature) yang disebut kompleks ssT-DNA-VirD2 . secara in vitro membuktikan bahwa kehadiran dari virD1 sangat dibutuhkan untuk memotong ssT-DNAoleh virD2. VirD2 pada saat itu melekat pada ujung 5’ akhir dari T-DNA dan memotongnya secara endonukleolitik sehingga akan membentuk gap (celah), dan helikase bakteri melepaskan T-DNA dari plasmid. Celah (gap)  untai tunggal pada plasmid tersebut akan segera diperbaiki. Kemudian  T-DNA  akan ditempatkan pada suatu cekungan yang diselubungi  dengan protein VirE2 yang disebut dengan hollow cylindrical filament dengan struktur yang bergulung. Ini adalah bentuk matang (mature) dari T-DNA yang siap masuk ke dalam sel tumbuhan.

            Sebenarnya ada dua model teori pengiriman kompleks ssT-DNA-VirD2  yang telah dikemukakan. Tetapi, yang banyak diterima adalah model penyelubungan untai tunggal oleh protein VirE2 (single strand binding protein virE2) dan mesin transfer (virB) kemungkinan tidak berinteraksi secara langsung dengan T-DNA. Pada alternatif model yang kedua,  kompleks ssT-DNA-VirD2  nampak telanjang  karena tidak diselubungi oleh virE2 sehingga terjadi interaksi langsung antara mesin transfer (virB) dengan kompleks ssT-DNA-VirD2, sedangkan virE2 ditansfer secara independent oleh mesin transfer ke dalam sel tumbuhan. Telah diketahui bahwa virE1 sangat dieprlukan untuk ekspor virE2 kedalam sel tumbuhan. Strain bakteri yang telah dimutasi virE1 nya tidak dapat mengekspor virE2 sehingga terakumulasi di dalam sel bakteri tersebut. T-DNA ditansfer ke tumbuhan sama halnya dengan konjugasi bakteri. Pertama-tama Agrobacterium membentuk suatu pilus yang merupakan ekpresi dari gen virB. Pilus ini menyerupai batang yang menghubungan dengan sel tumbuhan dan membuka saluran yang siap ditansferkan secara aktif T-DNA ke dalam sitoplasma tumbuhan. Pilus dan kompleks transport terdiri dari protein yang dihasilkan oleh gen vir.

            Kemudian, reseptor sitoplasma (plant cytosolic protein) tumbuhan mengenali signal lokasi inti pada virE2 dan vir D2 yang akan membentuk suatu kompleks dan membawanya menuju suatu lubang pada nukleus yang disebut nuclear uptake / nuclear pore dan mentransfer kompleks ssT-DNA-VirD2 kedalam genom tumbuhan. T-DNA akan terintegrasi kedalam genom tumbuhan secara illegitimate recombination (rekombinasi yang tidak ketahui mekanismenya) dan berubah bentuk menjadi untai ganda (double-stranded).  Integrasi ini membutuhkan DNA ligase, polymerase, dan protein yang mengubahnya menjadi kromatin (chromatin remodeling proteins) yang semuanya disediakan oleh tumbuhan.  VirD2 sangat diperlukan dalam ketepatan intergrasi ssT-DNA kedalam genom tumbuhan. Ekspresi dari integrasi gen T-DNA ini adalah produksi dari auksin, sitokinin dan opine. Opine adalah sekret yang dikeluarkan oleh sel tumbuhan dan dikonsumsi oleh Agrobacterium sebagai nutrisinya.

 Proses transfer T-DNA Agrobacterium tumefaciens

            Gen pada T-DNA akan diekspresikan sama halnya pada eukaryot yang memiliki promoters, enhancer dan bagian poly (A). Oleh sebab itu, ekspresi  dalam nukleus tumbuhan lebih baik dibandingkan pada Agrobacterium. Protein ini akan menyandi sintesis dua hormon pertumbuhan yang auksin dan sitokinin. Auksin membuat sel tumbuhan menjadi lebih besar dan sitokinin berperan dalam pembelahan sel. Sel tumbuhan yang diinfeksikan ini akan memulai tumbuh cepat dan tanpa kontrol sehingga menghasilkan tumor.

            T-DNA juga membawa gen untuk mensintesis opine yang mana merupakan variasi yang berbeda dari asam amino dan derivat gula fosfat. Opine dihasilkan oleh sel tumbuhan yang dikandung T-DNA tetapi digunakan oleh bakteri sebagai sumber carbon, nitorgen dan energi.  Ini adalah cara bagaimana bakteri menggunakan tumbuhan untuk menghasilkan sumber makanan bagi bacteri. Plasmid Ti selalu berada dalam Agrobacterium, membawa gen yang menyediakan bakteri untuk mendapatkan opin.

            Dalam prakteknya, Agrobacterium digunakan untuk mentransfer gen dari suatu kepentingan kedalam tumbuhan menggunakan kultur jaringan. Tiap pemisahan sel tumbuhan disebut protoplas  atau sebuah bagian dari kalus yang di kultur dengan Agrobacterium mengandung sebuah plasmid Ti yang dimodifikasi  T-DNA nya. Setelah kokultur, sel  tumbuhan dipanen dan di inkubasi dengan herbisida dan antibiotik yang digunakan sebagai marker selektif. Ini akan membunuh semua sel yang tidak ditransformasikan T-DNA atau gagal untuk mengekspresikan gen pada T-DNA. Sel yang telah ditransformasikan dapat di induksi untuk menghasilkan tunas dan jaringan akar dengan mengubah kondisi hormon pada medium mudah diuraikan. Tumbuhan transgenik yang masih kecil dapat dilindungi untuk level ekspresi transgen berikutnya.

Daerah T-DNA dari Ti plasmid dapat direkayasa genetika dengan menambah gen resisten antibiotik (antiobiotic resistance gene (kan^R)) dan DNA asing yang diinginkan. Integrasi DNA asing kedalam sel tumbuhan mengganggu pembentukan tumor dan hanya sel tumbuhan dengan gen kan^R yang dapat tumbuh pada kultur yang mengandung antibiotik. Tumbuhan sangat mudah beregenerasi dari kultur sel (kalus) dan tumbuhan transgenik yang telah dewasa mengekspresikan gen asing.

 Produksi tumbuhan transgenik dengan menggunakan integrasi Ti plasmid.

Baru-baru ini, sebuah metode yang disebut dengan in planta Agrobacterium transformation telah dikembangkan dan merevolusi dunia transformasi tumbuhan. Transformasi in planta juga diketahui sebagai metode floral dip. Metode ini telah dikembangkan menggunakan tumbuhan model Arabidopsis tetapi sedang diperluas untuk tumbuhan lain, seperti gandum dan jagung (Gambar 16): A. Pertama, Arabidopsis ditumbuhkan sampai tunas bunga mulai terbentuk. Tunas kemudian dipindahkan dan dibiarkan beregenerasi untuk beberapa hari. B. Ketika mulai beregenerasi, tumbuhan dicelupkan ke dalam suspensi Agrobacterium yang berupa surfaktan. Surfaktan Agrobacterium dibiarkan untuk melekat pada tumbuhan dan mentransfer T-DNA nya. Karena tunas bunga sudah mulai terbentuk, T-DNA akan menjadi bagian dari jaringan ovarium sampai akhirnya tumbuhan menyelesaikan pertumbuhan dan pembentukan bibitnya. C. Tanaman dipelihara selama beberapa minggu hingga dewasa dan kemudian bibit anakan dipanen. D. Bibit tersebut dipanen dan ditumbuhkan pada medium selektif untuk mendapatkan gen yang terintegrasi dan ekpresi T-DNA. Meskipun, metode ini memberikan persentase rendah terbentuknya transforman.

Metode in planta Agrobacterium transformation

 Agrobacterium merupakan sistem transformasi gen yang menguntungkan karena efisiensinya tinggi dan integrasinya stabil.  Agrobacterium tumefaciens dinyatakan dapat membawa setiap gen yang diinginkan di dalam T-kompleks dan memasukkannya ke dalam DNA target pada tanaman dengan tingkat keberhasilan yang tinggi.  Hal tersebut dikarenakan untai T-DNA Agrobacterium tumefaciens tidak seperti komponen genetik mobile pada transposon dan retrovirus yang menyandikan fungsi bagi pergerakan dan integrasi DNA. 

Transformasi dengan Agrobacterium juga memiliki beberapa keuntungan lain, diantaranya bersifat dapat diulang (reproducible), relatif lebih murah, memberikan pola integrasi yang tegas, jumlah salinan dalam genom sedikit (1-3 salinan) sehingga memudahkan untuk membedakan sifat ekspresi tanaman transgenik itu sendiri..  Pada awalnya teknik transformasi dengan Agrobacterium hanya berhasil pada tanaman dikotil ketika tanaman ini menghasilkan senyawa induser untuk menginduksi gen vir ketika tanaman luka dan mengeluarkan getah. Tanaman tembakau dan solanaceae adalah contoh pertama tanaman dikotil yang berhasil ditransformasi.

Selain menyisipkan gen target untuk perubahan sifat tanaman tertentu yang dikehandaki, transformasi genetik dengan Agrobacterium pada tanaman juga bermanfaat untuk membuat populasi tanaman mutan. Dengan menggunakan Agrobacterium memungkinkan diperoleh mutan dalam jumlah banyak dalam suatu periode yang relatif singkat. Pembuatan mutan dilakukan dengan menggunakan elemen loncat (transposon) misalnya transposon Ac/Ds. Transposon Ds akan berpindah posisi dalam genom pada tempat berbeda dan tersisip pada gen-gen fungsional.  Sedangkan elemen Ac menyandikan suatu enzim yang mengaktifkan elemen Ds untuk bertransposisi. Adanya penyisipan Ds ini memungkinan fenotipe tanaman menjadi beragam. Keragaman mutan ini dapat dijadikan sebagai sumber plasma nutfah baru untuk selanjutnya dapat dilakukan isolasi gennya (Mulyaningsih, 2009).

Proses transformasi gen via Agrobacterium juga dapat dilakukan dengan sistem vektor biner. Sistem vektor biner yang diterapkan dalam proses transformasi gen via Agrobacterium dapat meningkatkan efisiensi transformasi. Sistem binary vector merupakan penggunaan dua plasmid Ti secara bersama dan saling berhubungan untuk proses tranfer gen. Kedua plasmid Ti tersebut terdiri dari satu plasmid pembawa range replikon yg luas (ORI dari E.coli dan Agrobacterium tumefaciens, T-DNA yang mengandung multiple cloning site, gen resistan antibiotik) sedangkan plasmid pasangannya mengandung gen virulence (vir-region) tanpa T-DNA. 

Umumnya Agrobacterium tumefaciens sebagai media transformasi gen relatif efisien diterapkan pada spesies tumbuhan. Dilain pihak, ada beberapa spesies tanaman yang tingkat keberhasilan transformasinya rendah, sebagian besar adalah  jenis tanaman monokotil.  Namun, menurut Mulyaningsih (2009) pengembangan penelitian terkini dapat mengatasi kelemahan tersebut dengan melakukan beberapa penyesuaian kondisi seperti penambahan senyawa induser dan pH saat ko-kultivasi.   Hiei dkk (1994) dalam Mulyaningsih (2009) dalam telah berhasil membuktikan bahwa tanaman padi jenis japonica berhasil ditransformasi menggunakan Agrobacterium dengan material tanaman berupa sel kalus embriogenik. Dalam penelitiannya Hiei dkk menambahkan senyawa asetosiringone pada media dan menggunakan media dengan pH 5,2 saat ko-kultivasi. Hingga saat ini studi transformasi genetik dengan Agrobacterium terhadap tanaman pangan seperti padi terutama jenis indica (yang banyak dibudidayakan dan dikonsumsi) terus dilakukan.  Beberapa jenis tanaman pangan dan non pangan hasil transformasi dengan Agrobacterium di Amerika yang dilaporkan ialah kedelai, kapas, jagung, bit, , gandum, canola, creeping bentgrass (untuk pakan).

Read More

Konsep Plant Breeding

A.    PENGERTIAN

Plant Breeding yaitu suatu ilmu, seni dan bisnis dalam mengembangkan kegunaan dari suatu tanaman, yang diperuntukkan untuk kehidupan manusia (Bernardo, 2002). Dari segi keilmuan, prinsip Plant Breeding berdasarkan pengetahuan Genetik, Hereditas, Bioteknologi serta ilmu lain yang berhubungan dengan tanaman (anatomi tumbuhan, fisilogi tunbuhan dll). Jika ditinjau dari segi seni, prinsip Plant Breeding berdasarkan kemampuan seseorang dalam melakukan persilangan tumbuhan agar mendapatkan hasil persilangan yang diharapkan. Jika ditinjau dari segi bisnis, prinsip Plant Breeding berdasarkan cara mengatur (management skill) sumber daya yang ada disekitar kita (alam, tenaga, dan modal) agar mendapatkan hasil persilangan yang optimal. Ketiga unsur ini harus benar – benar dicermati dan dilakukan oleh seseorang yang akan melalukan persilangan tumbuhan.

Variasi dari hasil persilangan yang kita buat tergantung pada faktor genetik dan lingkungan. Komponen genetik yang menyebabkan variasi dapat dirunut dari hibridisasi dan rekombinasi. Untuk menghasilkan persilangan yang baik, maka sifat unggul parental pun harus diperhatikan.

B.     TIPE – TIPE PLANT BREEDING

a.      Single Cross

Single Cross yaitu persilangan antara kultivar yang berbeda. Pada beberapa kasus memungkinkan segregasi dari indukan yang sama. Setiap persilangan harus terdiri dari jalur indukan yang unggul agar menghasilkan keturunan yang optimal.

Gambar 1. Skema persilanga Single Cross (Pohlmen and Sleper, 1995).

b.      Top and Double Cross

Jenis persilangan ini yaitu menyilangkan antara F1 dengan varietas lain. Tujuan dari menggunakan metode ini yaitu untuk meningkatkan peluang variasi genetik yang diinginkan. Peran yang menjadi Parental betina F1 harus benar – benar dipilih.

Gambar 2. Skema persilangan Double Cross (Pohlmen and Sleper, 1995).

c.       Backcross

Jenis persilangan ini mengandung kultivar yang diadaptasikan dan ditanam disuatu daerah yang sama. Tetapi metode jenis ini memiliki kekurangan lemahnya sifat yang dihasilkan (resesif). Sifat yang diinginkan justru akan muncul pada kultivar lain, tetapi masih berasal dari parental yang sama. Tujuan utama dari melakukannya Backcross yaitu untuk menghasilkan alel yang eksotik (lain daripada yang lain). Metode Backcross sangat mudah membawa sifat yang diturunkan, dominan sangat mudah dikenali bahwa itu adalah tanaman hasil persilangan (Pohlmen and Sleper, 1995).

Gambar 3. Skema persilangan Backcross (Pohlmen and Sleper, 1995).

d.      CIMMYT and Single Backcross Strategy

Jenis persilangan ini membolehkan kita untuk membuat suatu populasi persilangan untuk memonitori sifat karakteristik dari kultivar parental. Pengaruh dari jenis persilangan ini yaitu dapat meningkatkan kemungkinan memonitori dan memilih sifat gen yang diinginkan dari parental sebelumnya; membolehkan transfer multipel gen atau multipel karakter secara bersamaan; membolehkan adanya tambahan gen atau karakter dari parental donor yang dipih (Newell and Burke, 2000).

Gambar 4. Hasil persilangan CIMMYT and Single Backcross

Para peneliti di China baru-baru ini menyilangkan gandum sintetik CIMMYT dengan gandum lokal dan mempublikasi hasil untuk pada tahun 2003. Breeder di provinsi Sichuan telah menggunakan gandum hexaploid CIMMYT yang dikembangkan secara sintetis sejak tahun 1995 untuk meningkatkan kualitas, potensi hasil, dan ketahanan terhadap penyakit. Setelah menyilangkan dan backcross gandum ini dengan varietas unggul lokal, mereka telah mengembangkan beberapa keturunan dan saat ini pengujian kurang lima keturunan lagi.

Gandum sintetis memiliki sifat menguntungkan seperti biji besar, paku berat,dan ketahanan terhadap karakter baru. Selama dua tahun percobaan, dua varietas yang berasal dari gandum sintetik telah menghasilkan 20% sampai 35% lebih tinggi dari ladang milik komersial yang dikerjakan secara konvensional. Salah satu varietas, bernama Chuanmai42, memiliki tertinggi Rata-rata hasil lebih dari enam ton per hektar - dalam percobaan. Sejak dirilis pada Sichuan pada tahun 2003, Chuanmai42 telah direkomendasikan oleh pemerintah untuk petani dan telah dikirim ke sebagian besar program riset pemuliaan gandum di Cina.

e.       Recording Pedigress

Jenis persilangan ini membawa sekuens kultivar yang sudah diketahui sumber informasinya dan infrormasi tersebut sangat penting. Setiap garis pada metode Pedigree secara umum sudah mencangkup field books dan crossing books. Metode jenis ini memiliki beberapa aturan, yaitu :

·         Parental betina diposisikan pada urutan pertama, lalu dibagi dari parental jantan dengan cara :

-          Tanda slash tunggal (/).

-          Tanda slash ganda (//).

-          Tanda slash ganda dengan menyisipkan angka setelah tanda slash (/1; /2).

·         Unsur parental terdiri dari beberapa bagian hasil persilangan.

Contoh : Parental 1 : Logan/Heart//3270-A/Ruskalka

Gambar 5. Contoh persilangan Pedingree (Chrispeels and Sadava, 2002)

REFERENSI

Bernardo, Rex. 2002. Breeding for Quantitative Traits In Plants. Stemma Press. New York.

Chrispeels, M. J., and D. E. Sadava. 2002. Plants, genes and agriculture. 2nd ed. Boston: Jones and Bartlett.

Newell McGloughlin, M., and J. Burke. 2000. Biotechnology—Present position and future developments. Dublin, Ireland: Teagasc.

Pohlmen, John Milton and D.A Sleper. 1995. Breeding Fields Crops 4 ^th Edition. Iowa State University Press. Ames Iowa.

Read More