Mengenal Teknik-Teknik Transfer Gen ke dalam Sel.

Mikroinjeksi

Pada artikel sebelumnya, Mengenal teknik-teknik dalam rekayasa genetika, telah dibahas berbagai macam teknik-teknik utama dalam rekayasa genetika. Salah satu teknik tersebut adalah bagaimana peneliti memungkinkan gen ditransfer secara efektif ke dalam sel. Pada dasarnya, teknik-teknik yang akan dibahas pada artikel ini, biasa digunakan untuk transfer gen ke dalam sel hewan.mikrobia maupun sel tanaman.  Khusus untuk transfer gen pada tanaman dapat anda baca pada artikel Teknologi Tanaman Transgenik.

Suatu gen hasil isolasi dapat ditranskripsi secara in-vitro dan mRNAnya juga dapat  ditranslasikan pada suatu sistem bebas sel. Teknik ini memungkinkan peneliti memperoleh sejumlah protein dalam jumlah kecil, yang mungkin tidak cukup untuk beberapa penelitian biokimia, atau untuk penentuan aktifitas biologi protein tersebut secara in vivo atau menentukan strukturnya melalui proses kristalisasi.

Untuk disandikan secara efektif dan ditranslasikan menjadi protein, suatu gen harus ditransfer ke dalam sel, yang secara alami mungkin mengandung semua faktor-faktor yang diper.lkan dalam proses transkripsi dan translasi.

Membran plasma pada berbagai jenis sel yang berbeda merupakan barier yang memungkinkan pengambilan senyawa secara selektif. Pada beberapa kasus, molekul masuk ke dalam sel melalui pori-pori yang terbuka dan tertutuo melalui suatu kontrol oleh sel. Senyawa-senyawa pembawa khusus juga dapat metranspor molekul-molekul untuk kemudian ditransfer ke dalam sel. Pada kasus yang lain, molekul mengenali reseptor-reseptor khusus di bagian luar membran plasma dan membentuk kompleks yang memodifikasi membran secara lokal, yang mengarhkan internalisasi kompleks serta membran yang mengelilinginya, Proses ini disebut endositosis.

DNA merupakan molekul bermuatan negatif dan berukuran besar. DNA tidak bisa melintasi membran plasma secara spontan. Mekanisme ini merupakan cara sel untuk melindungi diri dari DNA asing yang mungkin ada di sekitarnya, Oligonukleotida yang ditambahkan ke medium kultur sek atau diinjeksikan ke dalam hewan dapat memasuki sel pada kondisi dimana mereka ada dalam konsentrasi tinggi,

Ada berbagai teknik yang bisa digunakan untuk proses transfer gen, diantaranya: 1). Fusi sel; 2). Penggunaan senyawa kimia; 3). Elektroporasi; 4). Injeksi menggunakan vektor virus; 5) Mikroinjeksi.

A. Fusi sel

Sebuah plasmid dapat ditransfer dengan menggabungkan protoplas bakteri dengan sel yang akan ditransfeksikan. Metode ini sebenarnya tidak efesien dan jarang digunakan. Kekurangan lainnya adalah semua gen bakteri juga ikut ditransfer ke dalam sel.

Fusi sel bakteri dan yeast

B. Menggunakan senyawa kimia

Karena, penggabungan DNA secara in-vitro dengan berbagai molekul yang membentuk suatu kompleks yang memasuki sel bersifat efesien maka teknik ini paling umum digunakan, Salah satu molekul yang biasa digunakan adalah kalsium klorida. Gugus fosfat DNA terikat ke kalsium menghasilkan suatu kompleks tidak larut, yang berpresipitasi jika kelebihan kalsium dan fosfat ditambahkan ke DNA. Campuran tersebut ditambahkan ke dalam medium kultur. Sejumlah kecil compleks tidak laurt yang melingkupi sel kemudian di endositosis secara spontan. DNA kemudian dilarutkan ulang di dalam sitoplasma sel. Sebagian besar DNA yang masuk didegradasi dan sisanyabisa mencapai nukleus, dimana DNA tersebut  kemudian ditranskripsi.

Metode fisik

C. Elektroporasi

Metode ini dilakukan dengan menaruh sel ke medan listrik arus bolak balik. Hal ini menyebabkan pori sementara di dalam membran plasma. DNA yang ditambahakan pada medium elektroporasi dapat masuk ke dalam sel melalui pori. Medan listrik juga menginduksi mobilitas DNA dan memungkinkan pengambilannya oleh sel.  Metode ini sedikit efesien dan biasanya digunakan dengan jenis sel dimana penggunaan senyawa kimia kurang bisa dihandalkan, Sejumlah sel dihancurkan karena pengaruh medan elektrik tersebut, Sehingga teknik ini merupakan metode yang baik untuk menghasilkan klon dengan DNA yang benar-benar terintegrasi. Elektroporasi dalam teknik terbaik untuk transfer gen ke dalam sel punca embrionik  (embrionic stem cell) dan menempatkan suatu gen endogen melalui rekombinasi homolog.

Transfer gen dengan elektroporasi

D. Infeksi dengan vektor virus

Berbagai vektor virus digunakan untuk mentrasfer gen ke dalam sel. Beberapa gen esensial dihapus dari genom virus. Delesi ini menghasilkan genom virus mampu atau tidak mampu ber replikasi secara otomatis. Hal ini juga membuat ruang di dalam genom virus untuk kemudian disisipkan gen asing. Genom hasil rekombinasi ini sudah tidak mampu menghasilkan partikel virus fungsional, karena protein virus yang esensial sudah hilang. Genom virus hasil rekombinasi tersebut harus ditransfer ke dalam sel yang kemudian diekspresikan secara sementara atau secara stabil. Sel hasil transformasi ini kemudian mampu mensintesis partikel virus yang mengandung gen asing. 

Transfer gen dengan vektor virus

E. Mikroinjeksi

DNA di dalam larutan dpat dimikroinjeksikan secara langsung ke dalam sitoplasma sel atau nukleus. Teknik ini sulit dan membutuhkan persyaratan khusus (mikroskop dan mikroinjektro) dan latihan khusus.

Teknik transfer gen dengan mikroinjeksi

Artikel ini sebagian besar disarikan dari Houdebine, LM. 2003. Animal Transgenesis and Cloning. Wiley England.

Read More

Mengenal Teknik-teknik dalam Rekayasa Genetika

Rekayasa genetika adalah kegiatan manipulasi gen dengan teknik DNA rekombinan dengan tujuan mengubah, menghilangkan atau memunculkan ekspresi gen tersebut pada suatu organisme hidup.  Obyek rekayasa genetika mencakup hampir semua golongan organisme, mulai dari bakteri, alga,  fungi, tumbuh-tumbuhan,  hewan tingkat rendah, dan hewan tingkat tinggi. 

Ada beberapa tahapan utama dalam rekayasa genetika, yaitu:

1. Kloning gen
Kloning gen terdiri atas beberapa tahapan, diantaranya memotong DNA  menjadi fragmen-fragmen dengan ukuran beberapa ratus hingga ribuan kb (kilobase), selanjutnya fragmen ini dimasukkan ke dalam vektor bakteri untuk kloning. Berbagai macam vektor didesain untuk membawa DNA dengan panjang yang berbeda. Plasmid, kosmid, faga P1, BAC (bacterial artificial chromosome), dan YAC (Yeast Artificial Chromosome) dapat membawa DNA hingga 20 kb, 40 kb, 90 kb, 200 kb, dan 1000 kb secara berturut-turut. Setiap vektor, hanya mengandung satu fragmen DNA, dimasukkan ke dalam bakteri, yang kemudian teramplifikasi, membentuk suatu klon. Sejumlah besar setiap fragmen DNA kemudian diisolasi dari setiap klon. Ekspresi kloning gen telah disimpan dengan perbanyakan kloning yang dilakukan pada bakteri yang mengandung fragmen DNA tersebut.

Teknik Kloning Gen

Kloning fragmen DNA secara langsung  yang mengandung gen tertentu seringkali tidak bisa dilakukan. Kloning cDNA yang tepat biasanya merupakan tahapan intermediat atau pertengahan. Untuk tujuan ini, mRNA suatu jenis sel diretrotranskripsi menjadi DNA menggunakan enzim reverse-transkriptase virus. DNA untai tunggal yang dihasilkan dengan caran ini kemudian diubah mejadi DNA untai ganda menggunakan DNA polimerase. Fragmen DNA yang dihasilkan selanjutnya dikloning ke dalam plasmid untuk menghasilkan bank cDNA.

2. Sequensing DNA
Sekuensing DNA terdiri atas penentuan urutan basa suatu fragmen DNA. Selama bertahun-tahun  sekuensing dilakukan dengan teknik yang butuh waktu dan proses lama. Sekarang proses ini bersifat automatis dan dilakukan dalam skala industri dan memungkinkan mensekuensing beberapa ribu kilobasa per hari.

3. Amplifikasi gen secara in-vitro
Teknik yang dikenal sebagai PCR (polymerase chain reaction) untuk amplifikasi DNA ini paling sering digunakan oleh praktisi biologi molekuler Teknik PCR mensintesis untaian komplementer suatu fragmen DNA yang dimulai dengan suatu primer. Untuk lebih jelasnya dapat dibaca pada artikel Mengenal Teknik PCR (Polymerase Chain Reaction).

4. Konstruksi Gen
Penelitian gen seringkali membutuhkan konstruksi gen fungsional yang dimulai dari berbagai elemen gen. Elemen-elemen ini mungkin daerah regulator atau mungkin daerah transkrip. Mereka bisa saja dalam struktur asli atau hasil mutasi dengan eksperimen. Konstruksi gen dapat membantu identifikasi daerah regulator yang mengontrol ekspresi gen. Daerah koding atau coding region mungkin mengandung struktur aslinya. Konstruk gen bisa digunakan untuk mengkaji pengaruh gen pada sel atau organisme secara menyeluruh. Daerah transkrip mungkin mengandung suatu gen reporter yang menyandi protein yang bisa dengan mudah divisualisasi atau dikuantifikasi berdasarkan aktifitas spesifik enzimnya.

Rekayasa genetika mungkin dapat digunakan pada skala industri untuk memprogram ulang sel atau organisme untuk menghasilkan rekombinan sifat terkait farmasi dan untuk mencegah  respon penolakan imun pada sel atau organ hasil transplantasi.

Berbagai metode ekspresi gen (Sumber: Houdebine, 2003)

Pada semua kasus, gen harus dikonstruksi secara eksprimen. Konstruks gen mengandung sedikitnya daerah promoter, daerah transkrip, dan daerah terminator. Dengan demikian, suatu konstruk gen kemudian bisa disebut sebagai vektor ekspresi.

Konstruksi gen mengimplikasikan penggunaan enzim restriksi yang memotong DNA pada daerah spesifik, sintesis oligonukleotida secara kimiawi, amplifikasi fragmen DNA secara in-vitro menggunakan teknik PCR, serta menyambungkan fragmen DNA yang berbeda dengan ikatan kovalen menggunakan enzim ligase. Sebagian besar, fragmen ini ditambahkan pada plasmid yang kemudian ditransfer ke dalam bakteri. Klon bakteri kemudian diselksi dan diamplifikasi.

Pemilihan elemen yang ditambahkan pada konstruk tergantung pada tujuan eksperimen dan khususnya pada jenis sel dimana konstruk tersebit akan diekspresikan. Kode genetik bersifat universal, bahkan jika beberapa kodon sering digunakan secara efektif pada jenis sel tertentu dibandingkan sel lain. Kode yang menentukan aktifitas sekuen regulator bersifat spesifik bagi setiap organisme. Promoter dari suatu gen bakteri tidak akan aktif pada sel tumubuhan maupun hewan, begitu pula sebaliknya.

5. Transfer gen ke dalam sel

Suatu gen hasil isolasi dapat ditranskripsi secara in-vitro dan mRNAnya juga dapat  ditranslasikan pada suatu sistem bebas sel. Teknik ini memungkinkan peneliti memperoleh sejumlah protein dalam jumlah kecil, yang mungkin tidak cukup untuk beberapa penelitian biokimia, atau untuk penentuan aktifitas biologi protein tersebut secara in vivo atau menentukan strukturnya melalui proses kristalisasi.

Untuk dikodekan secara efektif dan ditranslasikan menjadi protein, suatu gen harus ditransfer ke dalam sel, yang secara alami mungkin mengandung semua faktor-faktor yang diper.lkan dalam proses transkripsi dan translasi. Ada berbagai teknik yang bisa digunakan untuk proses transfer gen, diantaranya: 1). Fusi sel; 2). Penggunaan senyawa kimia; 3). Elektroporasi; 4). Injeksi menggunakan vektor virus; 5) Mikroinjeksi.

Untuk lebih detail, dapat anda baca pada artikel Mengenal Teknik-Teknik Transfer Gen ke dalam Sel.


Artikel ini sebagian besar disarikan dari Houdebine, LM. 2003. Animal Transgenesis and Cloning. Wiley England.

Read More

Mengungkap Komunitas Bakteri secara Molekuler: Teknik PCR-RISA

Analisis komunitas bakteri dilakukan untuk melihat keragaman komunitas bakteri di suatu sampel atau lingkungan tertentu, misalnya pada tanah, air,  buah, akar tanaman, atau pada kotoran ternak. Analisis ini biasanya dilakukan oleh para peneliti untuk melihat pengaruh senyawa maupun polutan tertentu terhadap struktur komunitas bakteri yang ada suatu tanah maupun lingkungan perairan.

Ada beberapa teknik  yang dapat dilakukan untuk melihat keragaman komunitas bakteri, baik secara kultur-dependen maupun kultur-independen (Jin et al., 2011; Fujita et al., 2010). Keterbatasan utama dari kultur-dependen adalah >99% mikrobia tidak dapat ditumbuhkan dengan teknik kultur standar  (Hugenholtz, 2002). Oleh karena itu pada kultur-independen marker yang digunakan umumnya berupa biomolekul seperti asam nukleat, lipid maupun protein (Rastogi & Sani, 2011).

Teknik molekuler dapat digunakan baik untuk pendekatan kultur-dependen maupun kultur-independen  (Fakruddin & Mannan, 2013). Secara luas, teknik ini dikelompokkan menjadi dua kategori utama, tergantung kemampuannya dalam mengungkap struktur dan fungsi diversitas bakteri (1) pendekatan analisis komunitas secara menyeluruh, meliputi hibridisasi DNA, sekuensing genom lengkap, metagenom, proteogenom, dan metatranskriptom (2) pendekatan analisis komunitas secara parsial; meliputi teknik fingerprinting (DGGE/TTGE, SSCP, RAPD, ARDRA, T-RFLP, LH-PCR, RISA, and RAPD), perpustakaan klon (clone library), Quantitatif-PCR, hibridisasi fluoresens-in situ, dan analisis lipid bakteri (Rastogi & Sani, 2011).

 Teknik PCR-RISA (Polymerase Chain Reaction-Ribosomal Intergenic Spacer Analysis)

Pada teknik RISA (Ribosomal Intergenic Spacer Analysis), daerah ISR (intergenic spacer region) antara 16S dan 23S rRNA diamplifikasi dengan PCR, didenaturasi dan dipisahkan pada gel poliakrilamid atau agarose dibawah kondisi terdenaturasi (Kirk et al., 2004). Daerah ini mungkin mengkode tRNA dan berguna untuk membedakan strain bakteri dan spesies yang berkerabat dekat karena heterogenitas panjang dan urutan ISRnya (Fisher & Triplett, 1999).

Intergenic Spacer Region ( ISR) (150-1500 bp)

 

  

Posisi daerah ISR pada gen 16s dan 23S rRNA. (Sumber: Biominewiki);  

 Daerah ISR mengandung heterogenitas yang penting baik panjang maupun urutannya. Dengan menggunakan primer yang menempel ke daerah konservatif di antara gen 16S dan 23S rRNA, profil RISA dapat dihasilkan dari bakteri yang hidup dominan di suatu sampel atau lingkungan. RISA menyediakan profil komunitas yang spesifik, dimana setiap pita menunjukkan setidaknya satu organisme dalam komunitas (Rastogi & Sani, 2006).

 Aplikasi, Kelebihan, serta Kelemahan PCR-RISA

RISA digunakan secara luas untuk analisis komunitas mikrobia berbagai macam sampel di lingkungan yang berbeda-beda. Risa telah dieksplorasi untuk membandingkan diversitas mikrobia di dalam tanah, di dalam rizosfer tanaman (Benizri et al., 2005), pada tanah yang terkontaminasi (Ranjard et al., 2000) , dan respon terhadap inokulasi (Rojaz-oropeza et al., 2010). Selain itu RISA juga telah diaplikasikan untuk studi dinamika mikrobia dalam bioreaktor (Qu et al., 2009) serta analisa sampel sputum untuk pengkajian penyakit (Nazaret et al., 2009).

Meskipun RISA memberikan estimasi komposisi komunitas mikrobia yang relatif cepat, secara teknis RISA membutuhkan kuantitas DNA yang besar. Selain itu visualisasi produk PCR-RISA menggunakan elektroforesis gel agarose dan poliakrilamid tidak praktis dan efesien dari segi waktu (Fisher & Triplett, 1999).

sumber: S. Ahmad Tahir

Read More

Teknik PCR (Polymerase Chain Reaction)

Polymerase Chain Reaction atau PCR adalah teknik atau metode penggandaan (replikasi) DNA secara in-vitro. Teknik ini memungkinkan kita untuk melakukan replikasi DNA di luar sel atau tubuh organisme hidup. Melalui teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah melimpah dengan dalam waktu singkat sehingga bisa membantu pekerjaan peneliti atau bidang lainnya terkait dengan penggunaan DNA sebagai objek kajian. Misalnya untuk , penentuan strain atau spesies organisme tertentu, deteksi penyakit, deteksi atau kajian gen, terapi gen, serta di bidang forensik.Teknik ini pertama kali ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1983 sehingga beliau memperoleh hadiah Novel atas temuannya tersebut.

Reagen yang digunakan:
1. DNA target hasil ekstraksi. Berdasarkan pengalaman penulis, DNA tersebut dapat diencerkan 5-10X, sesuai kebutuhan.
2. Sepasang primer yang komplementer dengan DNA target. Primer merupakan fragmen DNA berukuran pendek dengan panjang 10-25 basa yang akan dijadikan sebagai mengawali proses replikasi DNA sekaligus membatasi daerah DNA yang akan diamplifikasi,
3. DNA polymerase. Enzim ini berperan dalam mengamplifikasi DNA sesuai dengan urutannya.
4. dNTP, terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa DNA, yaitu dATP,dGTP, dTTP, dan dCTP. Berfungsi sebagai building block DNA yang baru dibentuk.
5. Buffer PC R (KCl, Tris-HCL, MgCl2). Buffer ini berfungsi untuk menjaga kestabilan reaksi agar berjalan secara optimum.
6. ddH2O atau  nuclease free water (merk dagang).Berfungsi sebagai pelarut.

Pada saat  ini  sudah tersedia berbagai macam kit-PCR yang sudah mengandung reagen-reagen tersebut, kecuali primer dan DNA target tentunya, sehingga kita tidak perlu mencampurkanya satu persatu.

Prinsip Kerja
Secara prinsip, PCR merupakan reaksi berulang atau berantai yang melibatkan 20-40 siklus, tergantung kebutuhan, yang terdiri atas 3 tahap sebagai berikut:
1. Tahap denaturasi (melting), pada suhu 94-96oC.
Pada tahap ini, ikatan hidrogen terputus dan DNA untai ganda masing-masing terpisah menjadi untai tunggal. Pada proses replikasi DNA secara in-vivo, proses ini dibantu oleh sejumlah enzim seperti enzim helikase dan girase. Karena sifatnya yang unik, dimana DNA terdenaturasi pada suhu tinggi dan kemudian dapat terenaturasi kembali pada suhu rendah, maka sifat ini dijadikan dasar untuk tahap denaturasi proses PCR dengan menggunakan pemanasan. Pemisahan ini memungkinkan penempelan primer yang komplemen dengan DNA target pada sekuen yang sesuai. Durasinya berkisar 1-5 menit, tergantung kandungan basa GC dari sekuen DNAnya. Semakin tinggi GC nya, maka waktunya lebih lama. Sepertihalnya pernah disebutkan bahwa ikatan GC (3 ikatan hidrogen) lebih kuat dibandingkan dengan AT.
2. Tahap penempelan (annealing), pada suhu 45-60oc
Setelah DNA terdenaturasi, kemudian suhu diturunkan sehingga primer dapat menempel pada bagian DNA yang komplementer dengan urutan basanya. Penempelan tersebut sifatnya spesifik. Suhu annealing yang tidak cocok menyebabkan kegagalan dalam replikasi DNA yang benar. Suhu Annealing (TA) bisa dihitung berdasarkan suhu melting (TM). Jika suhunya terlalu tinggi dari yang seharusnya, maka primer tidak dapat menempel pada DNA cetakan, sementara jika suhunya terlalu rendah akan menyebabkan penempelan pada daerah atau sekuen DNA yang tidak sesuai.
3. Tahap pemanjangan (elongasi), pada suhu 72oC (opsional).
Pada tahapan ini, enzim DNA polymerase melakukan sintesis DNA dengan menambahkan pasangan basa yang tepat, satu demi satu secara cepat,  pada sisi 3’ primer yang telah menempel pada DNA cetakan. Suhu untuk tahap ini tergantung pada jenis enzim polimerase yang digunakan. Khusus untuk Taq Polimerase, 72oC adalah suhu yang biasa digunakan.

3 tahap reaksi PCR

Deteksi produk hasil PCR
Meskipun produk PCR berupa jutaan copy fragmen DNA, produk ini tidak tetap dapat dilihat dengan mata telanjang. Oleh karena itu, diperlukan teknik finishing untuk dapat memvisualisasikan produk hasil PCR ini. Salah satu teknik yang banyak digunakan untuk visualisasi DNA adalah dengan elektroforesin dengan menggunakan gel atau poliakrilamid.  Dengan visualisasi ini memungkinkan kita untuk menentukan ukuran band pita DNA yang muncul sehingga menunjukkan apakah produk PCR yang dihasilkan adalah benar dan sesuai dengan yang diinginkan.

artikel ini disarikan dari wikipedia dan sumber lain serta berdasarkan pengalaman penulis

Read More

Analisis Filogenetik: Identifikasi Bakteri Secara Molekuler

Metode identifikasi bakteri secara garis besar dapat dibagi menjadi teknik genotipik yang berdasarkan pada profil materi genetik suatu organisme (utamanya DNA) dan teknik fenotipik yang berdasarkan pada baik profil sifat metabolik maupun beberapa aspek komposisi kimianya.  Sebelum berkembangnya teknik biologi molekuler, mikrobia dikarakterisasi berdasarkan sifat morfologi, fisiologi, dan koloninya. Biotyping, serotyping, bacteriocin typing, phage typing, pola kerentanan terhadap anti mikrobia, dan metode berbasis protein lainnya merupakan contoh metode fenotipik yang umumnya digunakan (Fakruddin, 2013). 

Dasar Klasifikasi Bakteri (Prakash et al., 2012).

Kelemahan metode fenotipik terkait tingkat reprodusibilitasnya, dimana metode tersebut memberikan hasil yang berbeda-beda apabila diulang, sehingga dianggap kurang handal (reliable). Selain itu, metode ini juga mengkarakterisasi organisme berdasarkan produk ekspresi gen yang sangat sensitif terhadap berbagai macam kondisi lingkungan seperti suhu pertumbuhan, fase pertumbuhan dan mutasi spontan. Kelemahan metode fenotipik ini menjadi dasar pengembangan metode genotipik berbasis DNA. Sehingga, metode genotipik berbasis DNA menjadi lebih popular dan diterima secara luas karena bersifat reprodusibel, praktis, menunjukkan perbedaan antar spesies yang lebih kontras serta dapat membantu menghindari duplikasi strain (Prakash et al., 2007). Metode genotipik ini dapat dibagi menjadi dua kelompok, yaitu teknik berbasis sidik jari atau pola dan teknik berbasis sekuen atau urutan DNA (Prakash et al., 2012). Pada  artikel ini akan dibahas teknik rep-PCR sebagai wakil analisis sidik jari serta identifikasi menggunakan gen 16S rRNA dan gen gyrB sebagai wakil teknik berbasis sekuen.

1.      Analisis Sidik Jari Menggunakan rep-PCR

Sebelumnya telah disebutkan bahwa salah satu metode genotipik untuk identifikasi bakteri adalah teknik berdasarkan sidik jari atau pola. Teknik ini secara khusus menggunakan metode sistematis dalam menghasilkan serangkaian fragmen dari DNA kromosom organisme. Fragmen ini selanjutnya dipisahkan berdasarkan ukuran untuk menghasilkan suatu profil atau sidik jari yang bersifat unik untuk organisme tersebut dan kerabat terdekatnya. Cukup dengan informasi ini, seseorang dapat membuat perpustakaan atau database sidik jari organisme yang telah dikenal dan dibandingkan dengan organisme uji. Ketika profil dari kedua organisme tersebut cocok, maka mereka dapat dianggap berkerabat dekat, biasanya pada tingkat strain atau spesies (Frakash et al., 2007).

Ada beberapa macam teknik sidik jari yang telah digunakan secara luas terutama untuk identifikasi strain bakteri di bidang epidemiologi serta ekologi mikrobia. Secara garis besar ada dua pendekatan umum dari teknik sidik jari untuk menentukan strain bakteri (Demezas, 2011). Pertama, berdasarkan analisis RFLP yang mendeteksi variasi sekuens dengan membandingkan ukuran dan jumlah fragmen restriksi yang dihasilkan melalui pemotongan DNA oleh enzim restriksi. Kedua, variasi multipel amplikon dengan ukuran berbeda yang merupakan produk amplifikasi dengan primer. Kelompok kedua ini mencakup repetitive sequence based-Polymerase Chain Reaction (rep-PCR) (Versalovic et al., 1994), Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) (Williams et al., 1990) dan Arbitrary Priming-PCR (AP-PCR) (Welsh & McClelland, 1990).

Rep-PCR pertama kali diperkenalkan oleh Versalovic et al. (1991) dan menghasilkan sidik jari DNA yang terdiri atas multipel amplikon DNA dengan ukuran berbeda-beda. Amplikon ini mengandung segmen kromosom DNA yang bersifat unik yang berada diantara sekuen repetitif, dimana sekuen repetitif tersebut menjadi target penempelan primer (tabel 1) dengan sekuen repetitif (Versalovic et al., 1999).

Ada tiga elemen sekuen DNA repetitif yang bersifat konservatif yang biasa digunakan untuk tujuan typing, yaitu sekuen REP, ERIC, dan BOX  (Genersch & Otten, 2003). Elemen REP (Repetitive Extragenic Palindromic) merupakan unit palindromik yang mengandung loop yang bervariasi pada struktur stem-loopnya (Stern et al., 1984). Elemen ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus)  ditandai dengan struktur palindromik pusat yang bersifat konservatif (Hulton et al., 1991). Sementara elemen BOX terdiri atas beberapa subunit berbeda yang bersifat konservatif, yaitu boxA, boxB, dan boxC dan hanya boxA yang diketahui memiliki sekuen yang sangat konservatif pada banyak bakteri (Versalovic et al., 1994).

Primer yang umum digunakan pada rep-PCR. (Charan et al., 2011)

                                                                          

rep-PCR telah banyak digunakan untuk berbagai tujuan, antara lain untuk identifikasi methylobacter yang berasosiasi dengan tanaman (Raja et al., 2008), untuk membedakan strain Eschericia coli dari ekologi yang berbeda (Dombek et al,. 2000), serta untuk penentuan diversitas genetik pada Pseudomonas fluorescence (Charan et al., 2011).

Contoh Profil REP-PCR serta dendrogramnya

2.      Identifikasi Bakteri dengan sekuen 16S rDNA dan gen gyrB.

Untuk identifikasi bakteri berbasis sekuen biasanya digunakan suatu marker, baik yang terdapat pada daerah gen maupun daeah DNA non-koding, dengan karakteristik antara lain: pertama, sebagian besar merupakan housekeeping gene yang ada pada semua bakteri; kedua,  memiliki polimorfisme yang tinggi sehingga membuatnya dapat dibedakan antara bakteri yang juga berbeda; ketiga, marker molekuler tersebut harus bersifat sangat konservatif pada beberapa daerah sehingga memudahkan untuk mendesain primer yang tepat untuk proses amplifikasi dengan PCR (Liu et al., 2012).  Ada beberapa gen dan daerah DNA yang memiliki kesemua ciri tersebut dan telah digunakan secara luas untuk identifikasi bakteri, diantaranya gen 16S rRNA, gen 23S rRNA, daerah ITS, gen rpoB, gen gyrB dan gen recA (Sacchi et al., 2002; Miflin & Blackall, 2001; Houpikian &  Raoult, 2001; Vos et al., 2012;) Wu & Ahn, 2011; Seo et al., 2009).

Pada tahun 1960-an, Dubnau et al. melaporkan sifat konservatif gen 16S rRNA pada  Bacillus spp. Penggunaan gen 16S rRNA yang luas untuk identifikasi dan taksonomi kemudian digagas oleh Woese et al. (1980) yang menunjukkan bahwa hubungan filogenetik  bakteri, termasuk semua bentuk kehidupan, dapat ditentukan dengan membandingkan suatu bagian kode genetik yang bersifat stabil. Kandidat untuk daerah ini termasuk gen yang mengkode 5S, 16S, 23S rRNA, maupun daerah IGS (Intergenic Spacer) (Clarridge, 2004). Akan tetapi gen 5S rRNA (120 bp) dan 23S rRNA (3300 bp) telah terbatas penggunaannya. Gen 16S rRNA (1650 bp) merupakan marker yang paling sering digunakan dan telah merevolusi bidang sistematika mikrobia (Prakash et al., 2007).

Daerah Konservatif dan Variabel Gen 16s rRNA.

Gen 16S rRNA mengkode rRNA subunit kecil ribosom organisme prokariot. Gen tersebut banyak digunakan dalam analisis filogenetik karena terdistribusi secara universal, bersifat konservatif, memiliki peran penting pada ribosom dalam sintesis protein, tidak ditransfer secara horizontal, serta kecepatan evolusi dengan variasi tingkat yang tepat di antara organisme. Molekul 16S rRNA memiliki daerah variabel dan konservatif, dimana primer universal untuk amplifikasi gen 16S rRNA secara lengkap biasanya dipilih dari daerah konservatif tersebut,  sementara daerah variabel lebih banyak digunakan untuk taksonomi perbandingan (Prakash et al., 2007).

 Gen gyrB menyandi subunit B protein DNA girase, DNA topoisomerase tipe II, yang berperan penting dalam replikasi DNA dan terdistribusi secara universal di antara spesies bakteri (Wang et al., 2007; Watt & Hickson, 1994; Huang, 1996). Kecepatan evolusi molekuler dari gen gyrB lebih cepat dibandingkan sekuen 16S rRNA (Yamamoto & Harayama, 1995). Sekuen gen gyrB telah banyak digunakan untuk identifikasi spesies bakteri, seperti spesies Campylobacter (Gunther et al., 2011), kelompok Bacillus subtilis (Wang et al., 2007), kelompok Bacillus cereus (La duc et al., 2011), dan spesies Pandorea (Coenye & LiPuma., 2002).

disarikan oleh S. Ahmad Tahir 

Read More

Elektroforesis DNA

Elektroforesis merupakan metode pemisahan serta analisis makromolekul (DNA, RNA, protein) dan fragmennya, berdasarkan ukuran dan muatan. Partikel dan molekul bermuatan bermigrasi dalam medium yang bermuatan listrik.Karena kecepatan migrasi berbeda tergantung muatan dan ukuran, diana komponen sampel dipisahkan ke dalam zona-zona dan ditampilkan dalam bentuk pola khusus. Prinsip elektroforesis ditemukan oleh Arne Tiselius ketika ia memisahkan serum manusia ke menjadi 4 komponen utamanya; albumin dan globulin a, b, dan g (Jan-Christer Janson, 2011).

Elektroforesis dalam larutan bebas atau gel berpori seperti 1-2 % agarose memisahkan sebagian besar protein menurut titik isoelektrik atau muatannya. Elektroforesis dalam gel seperti poliakrilamid memisahkan sebagian besar protein bedasarkan ukuran molekuler proteinnya (Jan-Christer Janson, 2011)

Gambar 1. Perangkat Elektroforesis SDS-PAGE

Metode ini diawali dengan preparasi sampel untuk membuat sampel bermuatan sama sehingga muatan tidak memengaruhi pergerakan komponen sampel dalam gel. Preparasi dilakukan dengan cara mendenaturasi protein menggunakan SDS (Gambar1) dan memutus ikatan disulfida pada struktur protein menggunakan beta-merkaptoetanol, bila perlu denaturasi didukung dengan memanaskan sampel. Selanjutnya gel poliakrilamida dibuat menggunakan cetakan gel membentuk lembaran segiempat dengan ketebalan tertentu. Setelah sampel dimasukkan dalam sumur gel, gel dialiri arus listrik sehingga komponen yang terdapat dalam sampel akan terpisah melewati matriks gel berdasarkan berat molekulnya (Davis, 1994)

Video. Elektroforesis Gel (sumber: youtube)

Untuk melihat pita komponen yang terbentuk, gel perlu diwarnai dengan pewarna khusus.Beberapa pewarna yang dapat digunakan dalam SDS-PAGE adalah Commasie Brilliat Blue dan Silver Salt Staining. Commasie Brilliant Blue mengikat protein secara spesifik dengan ikatan kovalen. Silver Salt Staining memiliki sifat lebih sensitif dan akurat namun membutuhkan proses yang lebih lama (Boyer, 1993).

Saat ini, elektroforesis gel yang membutuhkan protein  dalam jumlah microgram merupakan alat yang penting dalam biosains dan bioteknologi. Metode yang tepat untuk ekstraksi protein setelah elektroforesos telah dikembangkan, khususnya blotting protein membuat, yang membuat  persiapan kecil. Ada juga banyak contoh dimana protein dalam jumlah yang sangat kecil sudah cukup untuk analisis ukuran dan  komposisi serta struktur primernya. Pada akhirnya, ada kasus dimana bahan awal sangat terbatas, seperti ekstrak protein dari sejumlah kecil jaringan.Pada kasus ini, “ekstrak” protein mungkin cukup besar untuk analisis elektroforesis (Janson, 2011).

Referensi:

Boyer RF. 1993.Modern Experimental Biochemistry.Jilid 2. California: The Benjamin Cummings PCI. p. 25.

Cambell, N. A., J. B. Reece, L.G Mitchell. 2002. Biologi. Penerbit Erlangga. Jakarta.

Davis L,et al. 1994. Basic Methods: Molecular Biology. Jilid 2. Norwola:Appletn&Lange. p. 68.

Hutti-Kaul, R. and B. Mattiasson. 2003. Purification and Isolation of Protein. Marcel Dekker, Inc. New York.

Jan-Christer Janson. 2011. Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, and Applications, 3rd Edition. Joh & Wiley Inc. Canada.

Read More